均勻設計法優選仙茅提取工藝的試驗

蒲忠慧，杜永華，魏 琴，尹禮國，張 萍，張 龍，羅明華

（1.綿陽師范學院生命科學與技術學院，四川 綿陽621000；

2.宜賓學院 發酵資源與應用四川省高校重點實驗室，四川 宜賓644007；3.宜賓學院生命科學與食品工程學院，四川 宜賓644007）

仙茅為石蒜科植物（Curculigoorchioides Gaertn）的干燥根莖，味辛，性熱，有毒；具有調節免疫、抗氧化、保肝、抗高血糖、補腎壯陽及抗骨質疏松、抗炎和適應原樣等功效［1］，可用于陽痿精冷，筋骨萎軟，腰膝冷痹，陽痿冷泄等。研究表明，仙茅含有仙茅苷、苔黑酚葡萄糖苷等化學成分［2］；仙茅苷對自由基具有明顯的清除作用［3］，還具有免疫調節［4］和抗骨質疏松［1］等作用。目前，對仙茅的研究主要集中在化學成分及藥理活性方面，而對仙茅提取工藝的研究較少，聶詩明等［5］研究過仙茅水提液的提取工藝，對仙茅醇提物的工藝研究，罕見相關報道。因此，本試驗采用均勻設計法，以仙茅醇提物中的仙茅苷提取率為指標，選取粒度、乙醇濃度、固液比、浸泡時間及回流時間5個因素，優選出仙茅最佳提取工藝，并對其結論進行了驗證，為生產工藝的選擇提供科學依據。

1 材料

1.1 藥材 仙茅根，產地為四川，購自四川宜賓正源藥業有限公司，由其鑒定為石蒜科植物仙茅（CurculigoorchioidesGaertn）的干燥根莖；仙茅苷標準品：購自中國生物制品檢定所，生產批號：110771－200904，含量≥98%。

1.2 儀器與試劑 中草藥粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；旋轉蒸發儀R502B（上海亞榮生化儀器廠）；SW－CJ－IB型超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；恒溫水浴鍋（鞏義市英峪高科儀器廠）；所有試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 仙茅苷含量的測定

2.1.1 供試液的制備 精密稱取仙茅浸膏0.2g，加60mL蒸餾水，超聲處理20min，冷至室溫，過濾。濾液用乙酸乙酯萃取4次（30、20、15、15mL），合并4次萃取液，水浴蒸干，殘渣用50mL甲醇超聲溶解，冷至室溫，過濾，濾液轉至100mL容量瓶中，甲醇定容，搖勻即得。

2.1.2 標準液的制備 精密稱取仙茅苷標準品5.0mg，加甲醇溶解后定容至100mL容量瓶中，搖勻即得50μg／mL的仙茅苷標準品溶液。

2.1.3 標準曲線的制備 精密吸取仙茅苷標準液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL分別置于10mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，于282nm處測定吸收度［6］，得吸光度和質量濃度回歸方程為y＝0.0105x－0.0045，R2＝0.9996，結果表明，仙茅苷在10～50 μg／mL范圍內與吸光度呈良好的線性關系。

2.1.4 精密度試驗 精密吸取仙茅苷標準溶液5.0mL，置10mL量瓶中加甲醇至刻度，搖勻，連續測定6次吸光度，RSD為0.41%，結果表明該方法精密度良好。

2.1.5 穩定性試驗 精密吸取供試液5.0mL，分別在不同時間測定吸光度，重復3次，取平均值，RSD為4.41%，結果表明該方法穩定性較好。

2.1.6 重復性試驗 取同一批仙茅浸膏5份，各取0.2g，按上述供試液制備方法處理，測定吸光度，重復3次，RSD為2.44%，結果表明該方法重現性良好。

2.1.7 回收率試驗 取已測得仙茅苷含量的仙茅浸膏5份，各0.2g，分別精密加入仙茅苷標準液10.0mL（500μg），按供試液制備方法處理，計算回收率，平均回收率為92.76，RSD為1.0%，結果表明該方法回收率良好。

2.2 均勻試驗設計

2.2.1 均勻試驗安排 參考 Fudx［7］等的提取方法，對粉碎粒度、乙醇濃度、固液比、浸泡時間及回流時間5個影響仙茅苷提取率的因素進行考察，選取5因素10水平表（見表1）進行均勻設計，將仙茅根粉碎過篩，取100g，按以下條件（見表2），安排試驗。

水平 因素粒度（目）乙醇濃度（%）液固比（倍）浸泡時間（h） 回流時間（h）1 10～20 10 5 0.0 1.0 2 10～20 20 6 0.5 1.5 3 20～40 30 7 1.0 2.0 4 20～40 40 8 1.5 2.5 5 40～60 50 9 2.0 3.5 6 40～60 60 10 2.5 4.0 7 60～80 70 11 3.5 4.5 8 60～80 80 12 4.0 5.0 9 80～100 90 13 4.5 5.5 10 80～100 100 14 5.0 6.0

試驗號 因素χ1 χ2 χ3 χ4 χ5 1 1 3 4 5 9 2 2 6 8 10 7 3 3 9 1 4 5 4 4 1 5 9 3 5 5 4 9 3 1 6 6 7 2 8 10 7 7 10 6 2 8 8 8 2 10 7 6 9 9 5 3 1 4 10 10 8 7 6 2

2.2.2 均勻設計試驗結果

2.2.2.1 樣品含量測定結果 采用均勻設計試驗安排的仙茅浸膏的提取結果及仙茅苷提取率結果見表3，由表3可知，試驗條件5仙茅浸膏得率和仙茅苷提取率最高，其提取工藝為：粒度40～60目，乙醇濃度40%，液固比13倍，浸泡時間1h，回流時間1h。

2.2.2.2 均勻設計試驗結果 采用 Uniform Design Version 3.00對均勻設計試驗結果進行后退回歸分析，在顯著水平α＝0.10時，第一次回歸方程為y＝0.830 1－0.005 1x1＋0.000 7x2＋0.030 9x3－0.067 0 x4－0.071 8x5，復相關系數：R＝0.931 7；決定系數：R2＝0.868 1；F檢驗值（5.267）＞F臨界值（4.051）回歸方程顯著，剩余標準差s＝0.106 62，顯著性檢驗變量分析見表4。各自變量對仙茅苷的貢獻（偏回歸平方和）順序為粒度（0.119 7）＞回流時間（0.100 9）＞浸泡時間（0.078 1）＞液固比（0.058 2）＞乙醇濃度（0.003 3）。其中，藥材粒度、液固比、浸泡時間和提取時間對仙茅苷提取率有顯著影響，而乙醇濃度對仙茅苷提取影響不明顯。這是因為仙茅苷是水溶性物質，在乙醇中溶解度不高，在用乙醇對仙茅根粉進行提取時，水溶性雜質相對增高且不便于與待測試成分分離，對仙茅苷提取影響不明顯。

表3 仙茅含量測定結果

2.3 驗證試驗 按照仙茅苷提取的優化條件進行驗證試驗。根據回歸方程進行優化預測：粒度10～20目，液固比13倍，浸泡時間0h，回流時間1h。按上述條件進行驗證，結果顯示，煎煮液的仙茅苷含量為0.98%，在預測范圍內（1.14%±0.199），表明該優化條件是可行的。

表4 變量分析

3 分析與討論

3.1 本試驗采用紫外分光光度法測定仙茅中仙茅苷含量結果顯示，仙茅苷含量（0.94%）與黃燦華等［6］用紫外分光光度法測得的仙茅苷含量（1.03%）相近，而比聶詩明等［5］采用正交試驗法優選仙茅煎煮工藝得到的最高仙茅苷含量（50.78mg／100g）高。究其原因，一方面可能是醇提法比水煎煮法更易提取出仙茅中仙茅苷，另一方面也可能是由于提取過程中樣品處理方式以及含量測定方法的不同而引起的差異。聶詩明等仙茅將提取液經大孔樹脂純化后再采用高效液相色譜法測定仙茅苷的含量，而本試驗所得樣品只經過乙酸乙酯萃取純化處理，可能在處理過程中仙茅苷的損失較少。文獻報道［8－9］，高效液相色譜法測定仙茅中仙茅苷的含量均在0.1%～0.5%左右，均低于本試驗測定的結果，其原因可能是含量測定方法的差異對仙茅苷含量測定結果影響較大。可見仙茅苷含量測定方法的選擇是很重要的。

3.2 穩定性試驗結果表明，樣品溶液在9h以內測定的吸光度值無明顯變化，放置22.5h后測得的吸光度有所減少，RSD值偏大（4.41）。這可能是因為仙茅苷受到外界環境中的氧、水分等因素的影響，發生了化學結構的改變，而引起吸光度的變化。因此，供試液應及時進行相關試驗，對提取出來的仙茅浸膏、仙茅苷標準品也應及時保存在4℃的冰箱內，這樣可保證樣品及標準品中仙茅苷的穩定性。

3.3 本試驗通過均勻設計法考察仙茅的最佳提取工藝，結果表明，試驗條件5仙茅浸膏得率和仙茅苷提取率最高，其提取工藝為：粒度：40～60目，乙醇濃度40%，液固比13倍，浸泡時間1h，回流時間1h。經過后退回歸處理結果表明，對仙茅提取結果影響大小依次液固比、粒度、回流時間、浸泡時間，而乙醇濃度對其無影響。對剔除不顯著因素乙醇濃度后采用網格嘗試優化法［10］對重要的四個因素（粒度、液固比、浸泡時間、回流時間）進行優化，得到最優提取工藝為：粒度10～20目，液固比13倍，浸泡時間0h，回流時間1h，仙茅苷提取率的實測值（0.98%）在預測范圍內（1.14%±0.199），表明該工藝條件可行，比較經濟，且對提取設備條件要求低，適于工業化生產。另外，通過回歸方程找到最優化條件，預測性強，是優化中草藥提取工藝的有效方法。

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