Rh（D）陰性孕婦血液中胎兒微量Rh（D）紅細胞與新生兒溶血病發病率的相關性研究

周 英，李 健，呂文彬，陳 雪，王乃紅，迭 敏

（成都市血液中心，四川 成都610041）

Rh血型在臨床輸血中具有重要意義，也是人類紅細胞血型系統中最為復雜、最具多態性的系統，其中RhD抗原因其能引起溶血性輸血反應及新生兒溶血病而倍受重視［1］。新生兒溶血病（HDN）是由于母嬰血型不合，母體血中存在與胎兒血型抗原相應的免疫性抗體（IgG型），此種特異性抗體可通過胎盤進人胎兒，引起胎兒紅細胞破壞而發生溶血，并伴隨一系列病理損害，如黃疽，貧血，肝脾腫大等癥狀［2］。在我國，ABO血型不合導致新生兒溶血較多見，病情較輕；Rh（D）血型不合導致新生兒溶血較少見，但病情較重，具有黃疸出現早，發展迅速，病情危重等特點，易致死與致殘，它的治療的關鍵在于早發現，早預防，早治療［3］。因此，較早對 Rh（D）陰性孕婦進行胎兒是否發生Rh（D）血型不合導致新生兒溶血的評估顯得尤為重要。目前預防、診斷Rh（D）血型不合導致新生兒溶血病的基礎是檢測胎－母出血量［4］，采用血清學方法定性檢測母體是否被胎兒紅細胞致敏。隨著科學技術的發展，流式細胞術能對血液中微量細胞群進行定性及定量的分析，具有速度快、精度高、準確性好等特點；有資料顯示，通過流式細胞儀計數胎兒紅細胞的數量，此方法靈敏度可達0.001%，是目前檢測胎兒紅細胞的最佳方法［5］。本研究采用相關文獻［1］中建立的流式細胞術檢測Rh（D）血型不合導致新生兒溶血病，探討其在產前診斷中的價值。

1 材料與方法

1.1 研究對象

經Rh（D）抗原初篩實驗為陰性的醫院送檢孕婦標本30例，妊娠周期為20～38周，年齡為18～35周歲，其中27例在孕期大于32周后追蹤檢測2次。

1.2 試劑與儀器

抗－D（IgG）單克隆抗體（上海血液生物醫藥有限責任公司，效價1：32，批號20070119），RhD（IgM＋IgG）單克隆抗體（Biotest，德國，批號1110906），抗－D（IgM＋IgG）單克隆抗體（Dominion公司，加拿大，批號 NDMG04203），抗－D（IgM＋IgG）單克隆抗體（Celliance公司，英國，批號BMJ0506G），廣譜抗人球蛋白試劑（上海血液生物醫藥有限責任公司，批號20061221），FITC－抗人IgG（γ），F（ab’）2純化抗體（KPL公司，美國，批號2021002），EPICS XL流式細胞儀（COULTER，美國），CX41顯微鏡（OLYMPUS），三用電熱恒溫水溫箱（上海躍進醫療器械廠）。

1.3 方法

1.3.1 Rh表型血清學鑒定 RhD初篩及陽性判定按照《中國輸血技術操作規程》操作，RhD初篩陰性者的紅細胞分別與4種不同廠家和批號的單克隆抗－D做間接抗人球蛋白試驗（IAT），設陰性及陽性對照。與4批抗－D反應全部無凝集者判定為RhD陰性。

1.3.2 流式細胞術檢測用紅細胞的制備 取待檢孕婦紅細胞500μl，磷酸鹽緩沖液（PBS，PH7.4）洗滌3遍，配成細胞懸液，顯微鏡計數紅細胞的濃度，調細胞濃度為1×106／μl。同時設RhD陽性對照和陰性對照管。

1.3.3 流式細胞術分析 待檢孕婦紅細胞懸液（細胞濃度為1×106／μl）50μl，加人源單克隆IgG 抗－D（批號20070119）50μl混勻，37℃孵育30min，PBS洗滌3遍，加 FITC－抗人IgG（γ），F（ab’）2純化抗體15μl（濃度為3μg／15μl），室溫避光反應30min，PBS洗滌3遍，細胞以500uLPBS重懸，上機檢測。根據前向角散射（FSC）與側向角散射（SSC），設定“門”，使紅細胞與血小板、細胞碎片區別開來。收集50000個細胞，記錄光散射及熒光數據。每次測定前以Flowcheck調整儀器的光路和流路。

1.3.4 確定陰性閾值 取5份RhD陰性標本（經查證為未孕女性）作為陰性對照細胞，處理方法如上所示。對其紅細胞懸液進行流式細胞術檢測，以陽性反應細胞百分數均值（±2s）設定陰性閾值。

1.3.5 患兒標本血清學檢測HDN 在30例陰性孕婦產后，取患兒血液標本，采用血清學方法進行紅細胞直接抗人球蛋白試驗、抗體篩選或抗體鑒定試驗。根據試驗結果判定患兒是否為HDN（患兒Rh血型均為陽性）。

1.4 統計學處理

采用SPSS12.0進行統計分析。

2 結果

2.1 血型血清學結果

經Rh（D）抗原確認試驗，陰性孕婦標本為30例。

2.2 Rh（D）陰性孕婦血液中胎兒微量Rh（D）紅細胞流式細胞術檢測與患兒標本血清學檢測結果比較，見表1。

表1 Rh（D）陰性孕婦血液中胎兒微量Rh（D）紅細胞流式細胞術檢測與患兒標本血清學檢測結果比較

2.3 追蹤檢測兩次27例Rh（D）陰性孕婦血液中胎兒微量Rh（D）紅細胞比例，見表2。

表2 追蹤檢測兩次27例Rh（D）陰性孕婦血液中胎兒微量Rh（D）紅細胞流式細胞術檢測值比較

3 討論

Rh血型系統是人類血型中最具多態性和免疫遺傳特性的一個系統，迄今已發現含有49個獨立的抗原，是輸血醫學中除ABO血型之外最具臨床意義的一個血型系統。RhD抗原的高免疫原性常常會引起胎兒和新生兒溶血病（HDN）、溶血性輸血反應和自身免疫性溶血性貧血等疾病［6，7］。HDN是臨床常見的因母嬰血型不合導致新生兒溶血病，可以引起高膽紅素血癥、貧血等。雖然Rh（D）血型不合導致新生兒溶血病發生的機率較少，但其后果嚴重，孕期易導致流產、死胎，新生兒極易發生黃疸、水腫、貧血、肝脾腫大及膽紅素腦病，甚至死亡。在產前對Rh（D）陰性孕婦進行有效地評估顯得尤為重要。

本次研究采用流式細胞術檢測30例Rh（D）陰性孕婦血液中胎兒微量Rh（D）紅細胞；在孕婦產后取患兒血液標本，采用血清學方法進行新生兒溶血病的檢測。兩組數據由表1可以看出，Rh（D）血型不合，流式細胞術檢測與血清學檢測結果比較差異不顯著。有文獻報道［8］，Rh血型不合 HDN，由于RH抗原位點多且抗原決定簇在細胞外暴露多，比較容易被檢出，因此流式法和試管法的檢測陽性率均為100%。此次研究結果與報道基本相符。

胎兒細胞在母體內具有一定的消長規律。利用檢測母親外周血胎兒紅細胞進行非創傷性產前診斷的最佳時間一直存在爭議。但目前普遍認為，理想時間為早期和中期妊娠［9］。Sonda等［10］利用 CD71和GPA雙抗體經FACS技術證實NRBC的濃度在孕7～l8周最高。我們對孕婦體內胎兒微量Rh（D）紅細胞所占比例進行了追蹤檢測，由表2可以看出追蹤檢測兩次的數據比較差異不顯著。本次研究由于條件限制，僅對孕婦進行了2次追蹤檢測，在今后的研究中還可以進行更詳細的追蹤檢測，有待進一步探討。

本次研究的數據顯示，運用流式細胞術檢測妊娠24周左右的Rh（D）陰性孕婦血液中胎兒微量Rh（D）紅細胞的方法，能較早預測新生兒溶血病發生的可能性，在一定程度上有助于新生兒溶血病的早期預防、治療、診斷，為抗D引起新生兒溶血病患兒的換血治療贏得了寶貴時間，減少了出現嚴重后遺癥的可能性。本研究具有靈敏度較高、實驗結果易于判定、實驗的準確度和重復性較好等優點，在臨床上有較大的運用價值。建議Rh（D）陰性孕婦在24周左右常規做流式細胞術檢測，為Rh（D）血型不合導致新生兒溶血病提供了一種早期預防﹑診斷的可靠依據，具有一定的社會效益和經濟效益。

［1］周 英，陳 雪，李健等.流式細胞術檢測RhD（－）血液中微量D（＋）紅細胞的研究［J］.中國輸血雜志，2008，21（5）：346－348.

［2］萬艷紅.“O”型孕婦產前免疫學檢測對判斷新生兒溶血病價值的探討［J］.中國實用醫藥，2007，2（2）：47.

［3］楊江存，韓梅寧，張獻清.Rh血交換治療32例新生兒溶血病分析［J］.第四軍醫大學學報，2005，26（24）：2280.

［4］Moise KJ.Red blood cell alloimmunization in pregnancy［J］.Semin Hematol.2005，42（3）：169.

［5］王建中，臨床流式細胞分析［M］.上海：上海科學技術出版社，2005.372.

［6］Avent ND，Reid ME.The Rh blood group system：a review［J］.Blood，2000，95（2）：375.

［7］Urbaniak SJ.Alloimmunity to RhD in humans［J］.Transfus clin Biol.2006，13（1－2）：19.

［8］戎 霞，羅廣平，付涌水，等.流式細胞術在母嬰血型不合新生兒溶血病檢測中的應用［J］.熱帶醫學雜志，2008，8（8）：791－793.

［9］陳漢平，沈 怡，張漢鳳等.運用流式細胞技術分析孕婦外周血中胎兒有核紅細胞的比例與孕周的關系［J］.實用婦產科雜志，2002，3（18）：104.

［10］Sonda Sa1cshi.Arinam T Hanada H，et al.The proportion of fetal Nucleared red blood cells in maternal blood：estimation by FACS Analysis Prenat Diagn［J］.Blood，1997，17：743.