CYP17基因單核苷酸多態與子宮內膜異位癥和子宮腺肌病易感性的關系

張 峰，薛素萍，曲銀娥＊

（1.河北大學衛生職業技術學院，河北 保定071000；2.河北聯合大學基礎醫學院）

子宮內膜異位癥（endometriosis，EMs）是指內膜組織出現在子宮體以外的部位，一般僅見于生育年齡婦女；子宮腺肌病（Adenomyosis，Ad）是指子宮內膜腺體和基質侵入子宮肌層，多發生于40歲以上的經產婦。EMs和Ad均為雌激素依賴性疾病，臨床上常可并存，但發病機制及組織學發生不盡相同［1］。細胞色素P45017c羥化酶／17、20裂解酶由CYP17基因編碼，是雌激素代謝的關鍵酶，在一定程度上決定體內雌激素水平。CYP17基因5＇非編碼區翻譯起始點－34bp處T－C單核苷酸多態與前列腺癌［2］和子宮內膜癌［3］等疾病遺傳易感性有關，與內異癥的關系目前尚存在爭議［4，5］。本文應用PCR－RFLP技術，檢測了內異癥、腺肌病和健康女性CYP17基因－34bp處T－C單核苷酸多態，旨在探討CYP17基因單核苷酸多態與內異癥和腺肌病風險的相關性。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選擇2007年3月－2009年2月保定市第三醫院剖腹或腹腔鏡手術的61例子宮內膜異位癥患者（內異癥組）和59例子宮腺肌病患者（腺肌病組），所有病例均經病理確診；選擇同期在此院體檢的健康女性65例為對照組。3組年齡分別為29.47±2.3歲、32.15±1.9歲、30.9±3.2歲，組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。所有研究對象無血緣關系，月經周期規律，無其他內外科及內分泌疾病，排除家族性遺傳疾病如糖尿病、高血壓等疾病，術前三個月無服用激素類藥物及免疫抑制類藥物。

1.2 主要試劑和儀器

限制性內切酶MspA1I、dNTP和TaqDNA聚合酶為美國Promega公司產品，PCR擴增試劑盒購自加拿大Sangon公司，CYP17引物由北京賽百盛公司合成，凝膠電泳成像系統為FUJI FILM公司產品。

1.3 實驗方法

1.3.1 基因組DNA提取 清晨空腹采集5ml靜脈血，檸檬酸鈉抗凝，蛋白酶K消化－苯酚法提取外周血基因組DNA，－70℃保存。

1.3.2 引物設計與合成 根據Genebank查詢的基因序列，用Primer 5軟件，設計1對特異性引物，由北京賽百盛公司合成。

上游：5′－CATTCGCACTCTGGAGTC－3′

下游：5′－AGGCTCTTGGGGTACTTG－3′

片段大小為419bp

1.3.3 PCR擴增體系及程序 25μl反應體系：10×PCR buffer 2.5μl、去離子水17.3μl、上下游引物各5μl（20μM）、dNTPs 2μl、Taq聚合酶0.2μl（5U／μl）、模板 DNA 2μl（20ng／μl）。反應程序：94℃預變性5min，94℃變性1min，57℃退火1 min，72℃延伸1min，共35個循環，末次循環后，72℃延伸5min，4℃保存。

1.3.4 酶切鑒定基因型 PCR產物經限制性內切酶MspA1I于37℃酶切過夜，20μl酶切體系：10×NE buffer 2μl、雙蒸水12.3μl、PCR產物5μl、100×BSA 0.2μl、MspA1I0.5μl（10U／μl）。取10μl酶切產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，確定基因型。隨機選擇CYP17 3種基因型PCR產物，送北京賽百盛公司測序驗證基因型。等位基因頻率＝（2×純合子數＋雜合子數）／（2×受檢人群）。

1.4 統計學分析

應用SPSS16.0軟件進行統計學處理，基因型和等位基因頻率采用基因直接計數法計算，χ2檢驗比較各組間基因型及等位基因頻率差異，非條件Logistic回歸計算比值比（OR）及95%可信區間（CI），確定基因型與內異癥和腺肌病發生的關聯強度。

2 結果

2.1 CYP17基因MspA1I酶切后基因型檢測結果

PCR產物及酶切產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結果，可見CYP17基因擴增片段為419bp；CYP17基因－34bp處的T－C堿基置換后，產生一個能被內切酶MspA1I識別的位點，因此PCR產物經MspA1I酶切后，可產生3種基因型：野生純和型（A1A1）無 MspA1I酶切位點，僅有419bp 1個片段；突變純和型（A2A2）含有1個酶切位點，被切割為295bp、124bp 2個片段；雜合型（A1A2）被切割為419bp、295bp和124bp 3個片段（圖1）。隨機選擇CYP17 3種基因型PCR產物進行測序驗證，顯示堿基改變與酶切結果相吻合。

圖1 CYP17基因型圖譜

2.2 CYP17基因單核苷酸多態與內異癥和腺肌病的關系

內異癥組和腺肌病組A1A1基因型頻率及A1等位基因頻率均高于對照組，差異均有統計學意義；內異癥組與腺肌病組之間差異均無統計學意義（表1、表2）。3組基因頻率分布均符合 Hardy－Weinberg遺傳平衡定律。

表1 3組CYP17基因型頻率比較（例數）

表2 3組CYP17等位基因頻率比較 （%）

2.3 CYP17各基因型的相對危險度分析

非條件Logistic回歸結果表明：A1A1和A1A2基因型的個體發生內異癥的相對危險度（OR）分別是A2A2型個體的4.615倍和3.467倍，發生腺肌病的相對危險度分別是A2A2型個體的3.692倍和3.867倍，差異均有統計學意義（P＜0.05），提示A1A1、A1A2基因型可能增加內異癥和腺肌病發生的危險性，CYP17基因T－C單核苷酸多態與內異癥和腺肌病風險有關（表3）。

表3 CYP17 3種基因型相對危險度分析

3 討論

細胞色素P450c17α羥化酶／17、20裂解酶是雌激素合成代謝的關鍵酶之一，也是雌激素合成過程中的限速酶，介導類固醇17α羥化酶和17、20裂解酶活性，參與膽固醇前體向雄激素、雌激素或孕激素以及鹽皮質激素或糖皮質激素的轉化，由CYP17基因編碼。CYP17基因5′非編碼區翻譯起始點－34bp處有1個T－C單核苷酸突變，由于T－C的替換產生了限制性內切酶MspA1I的酶切位點，產生Al和A2兩種等位基因，當等位基因A2存在時，理論上可以增加基因的轉錄效率，提高酶的活性，促進雄激素合成增多［6］。

研究中發現，A1A1、A1A2和A2A2基因型頻率及A1等位基因頻率在腺肌病組和內異癥組之間差異無統計學意義，提示腺肌病和內異癥在CYP17基因T－C單核苷酸多態方面具有相似的發病機制；危險度分析顯示A1A1和A1A2基因型個體發生內異癥的相對危險度分別是A2A2型個體的4.615倍和3.467倍，發生腺肌病的相對危險度分別是A2A2型個體的3.692倍和3.867倍，表明A1等位基因為內異癥的高危險因素，A1A1和A1A2基因型為內異癥和腺肌病的易感基因型。Hsieh等［4］發現CYP17基因的A1純合子等位基因增加內異癥的危險性，李維麟等［7］發現攜帶A1等位基因的婦女患內異癥的風險可能更高，與我們的結論一致。Aban等［8－10］和 Garmer等［11］分別在對子宮內膜癌和卵巢癌的研究中得到相似結論，而王曉莉［12］等發現CYP17基因啟動子區T－C多態與成都地區子宮肌瘤發病風險無相關性。CYP17基因多態性增加內異癥易感性的機制目前仍不清楚，推測可能由于CYP17基因5′端啟動子－34bp處的T－C點突變上調了CYP17基因表達，進而造成雄激素合成增多；同時，可能A1等位基因結合、代謝循環中的雌激素能力較低［13］，因此，A1A1和 A1A2基因型個體雌激素水平較高，發生內異癥和腺肌病的危險增加，與臨床上絕經后內異癥和腺肌病病灶逐漸萎縮一致。

由于CYP17基因多態性具有明顯的地域和種族差異，且所選擇的內異癥和腺肌癥患者的臨床分期、月經周期等不同，加之基因間的相互作用，不同的研究可能得出不同的結論，尚需在不同人群中擴大樣本量進一步研究。

［1］樂 杰.婦產科學［M］.第6版.北京：人民衛生出版社，2005.354－361.

［2］Wright JL，Kwon EM，Lin DW，et al.CYP17polymorphisms and prostate cancer outcomes［J］.Prostate，2010，70（10）：1094.

［3］J Gao，YB Xiang，WH Xu，et al，A case－control study on genetic polymorphism of CYP17MspA（1）I and its association with endometrial cancer risk［J］.Zhonghua Zhong Liu Za Zhi，2007，29（4）：266.

［4］Hsieh YY，Chang CC，Tsai FJ，et al.Estrogen receptor alpha dinucleotide repeat and cytochrome P450c17alpha gene polymorphisms are associated with susceptibility to endometriosis［J］.Fertil Steril，2005，83（3）：567.

［5］Juo S.H，Wang T.N，Lee J.N，et al.CYP17，CYP1A1and COMT polymorphisms and the risk of adenomyosis and endometriosis in Taiwanese women［J］.Human Reproduction，2006，21（6）：1498.

［6］Kitawaki J，Kado N，Ishihara H，et al.Endometriosis：the pathophysiology as an estrogen－dependent disease［J］.Steroid Biochem Mole Biol，2003，83：149.

［7］李維麟.CYP17單核苷酸多態性的研究進展［J］.國際生殖健康／計劃生育雜志，2009，28（2）：118.

［8］Aban M，Arslan M，Tok E，et al.CYP17genetic polymorphism in patients with endometrial hyperplasia and cancer［J］.Int J Gynecol Cancer，2006，16（1）：448.

［9］劉 潔，楊興升.雌激素代謝基因CYP17和COMT單核苷酸多態與子宮內膜腺癌風險的關系［J］.山東大學學報（醫學版），2007，45（1）：18.

［10］Berstein LM，Imyanitov EN，Kovalevskij AJ，et al.CYP17and CYP19genetic polymorphisms in endometrial cancer：association with intratumoral aromatase activity［J］.Cancer Letters，2004，207（2）：191.

［11］Gamer EI，Erika EE，Berkowitz RS，et al.Polymorphisms of theestrogen metabolizing genes CYP17and catechol O methyltransferase and risk of epithelial ovarian cancer［J］.Cancer Res，2002，61（1）：3058.

［12］王曉莉，曾 靜，王 璟，等.雌激素代謝酶CYP17、CYP1A2基因多態性與子宮肌瘤易感性的關系［J］.中國婦幼保健，2011，26（27）：4201.

［13］Roberta MC，Heather SFe，Malcolm C，et al.Risk of Endometrial Cancer and Estrogen Replacement Therapy History by CYP17Genotype1［J］.Cancer Res，2001，61（2），848.