Desmin在大腸癌與癌旁組織中的表達及意義

張 晶，李衛凱，謝志威，劉健婷，梁齊合，何成彥，趙海豐

（1.江門市中心醫院 檢驗科，廣東 江門529070；2.吉林大學中日聯誼醫院；3.佳木斯大學第一附屬醫院，黑龍江 佳木斯154003）

大腸癌是當前嚴重危害人類健康的惡性腫瘤。全世界每年大約有100萬大腸癌新發例，49.2萬人死于大腸癌［1］。近年來，大腸癌的診斷及綜合治療水平取得了很大的進展，但其發病率和死亡率并未發生根本性的變化，因此大腸癌復雜的發病機制需要繼續不斷的研究。Desmin是一種重要的細胞骨架蛋白，在維持細胞內結構和胞外基質聯結中起重要的作用。近年來細胞骨架蛋白在惡性腫瘤的發生和侵襲中起的作用逐漸受到重視，骨架蛋白在各種惡性腫瘤中的研究也成為熱點，但是關于Desmin在惡性腫瘤中的研究較少，為此本文應用蛋白質組學中的先進技術－液質聯用技術研究了Desmin在大腸癌及癌旁組織中的表達及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 組織標本

收集佳木斯大學第一附屬醫院18例手術治療的大腸癌患者的腫瘤組織標本均經病理學檢查證實及各患者距離腫瘤組織邊緣10cm以外的上端癌旁組織標本，術前均經患者同意。患者術前均未接受任何治療，年齡49－78歲，中位年齡57歲，其中男13人，女5人。將所獲得的新鮮標本離體后用生理鹽水沖洗干凈后，放入液氮冷凍，－80℃保存。

1.2 主要試劑

Bio－Rad公司的碘代乙酰胺（IAA）、尿素（Urea）、硫脲（Thiourea）、三羥甲基氨基甲烷（Tris base）、3－［（3－膽酰胺丙基）－二 乙胺］－丙磺酸（CHAPS）、碳酸氫氨、苯甲基磺酰氟（PMSF）、Sigma公司的DNA酶和RNA酶、超純水、安捷倫公司的1200納升級液相色譜分析儀和賽默飛世爾公司的LTQXL離子肼質譜儀。

1.3 實驗方法

（1）組織總蛋白質的提取及蛋白濃度分析：對組織標本進行研磨，裂解，低溫勻漿，離心，將蛋白上清液吸出備用，使用核酸蛋白分析儀檢測后利用標準曲線分析計算蛋白濃度。

（2）組織蛋白水解多肽混合物的制備：提取的組織蛋白用25mM NH4HCO3稀釋，使尿素濃度低于2M，加入1M的DTT，充分混勻，使其終濃度為20 mM，56℃下還原1h后降至室溫加入1M的碘乙酰胺混勻使其終濃度為50mM，常溫下避光反應30分鐘，按1∶50加入測序級胰酶37℃酶切過夜。

（3）二維色譜與質譜聯用分析與數據庫檢索：將所有樣品用緩沖液A溶解，各取50μg樣本上樣經反相色譜洗脫的多肽應用LTQ XL質譜儀檢測，核質比檢測范圍為400－2000amu，應用數據依賴方式進行次二級質譜掃描。

（4）應用實驗中每個蛋白的譜圖數來評價其豐度。對于在不同樣品中豐發生變化的蛋白，其譜圖數變化必須滿足以下原則：1、兩個樣品中譜圖數的比值大于等于1；2、兩個樣品中譜圖數的差值大于等于72（平均每次實驗差值為24）。每個樣品進行三次實驗，然后將結果相互比較分析，將腫瘤與癌旁組織的蛋白質組分析的結果進行比對，將得到的有顯著差異的蛋白，挑選出Desmin進行免疫印跡實驗驗證準確性。

1.4 統計學分析

液質聯用圖譜依據SEQUEST算法，使用SPSS13.0統計軟件包進行t檢驗。P＜0.05為有顯著性差異。

2 實驗結果

2.1 通過液質聯用技術鑒定出在腫瘤組織中與癌旁組織中表達有顯著差異蛋白，結果見表1。

表1 二維色譜與質譜鑒定的有顯著差異的腫瘤組織下調蛋白

2.2 本文著重探討Desmin蛋白，Desmin蛋白免疫印跡結果見下圖。

圖中AB分別代表癌旁組織及癌組織，表明Talin在腫瘤組織中較癌旁組織中表達降低，具有顯著性差異。

3 討論

大腸癌是我國常見的惡性腫瘤之一，其生長、轉移、復發是一個連續過程，因此，闡明大腸癌的發生、發展和轉移機制及其影響因素是目前腫瘤研究的重大課題。以往很多研究證明大腸癌的生長是個復雜的多基因參與的多步驟過程，明確其相關基因及蛋白質的作用，研究其發生和發展的機制，篩選和鑒定大腸癌生物學標志物，從而在腫瘤治療取得突破，也就成為腫瘤研究的最前沿領域和熱點。腫瘤蛋白質組技術為實現上述研究提供了可靠的新技術。

正常細胞中細胞骨架穩定，細胞運動很少，癌變的細胞細胞骨架破壞，細胞運動增加［3］，這是癌細胞突出特點，向外圍組織侵襲，細胞遷移運動調節機制在此過程中起重要作用。結蛋白是476個氨基酸構成的一種高度保守的肌肉組織中間絲蛋白，包括一個起調節蛋白結合的氨基端，一個含有二聚化結合位點的羧基端，和一個α螺旋的桿狀體區，其中桿狀體區又分成1A、1B、2A和2B四個結構域［2］。結蛋白通過網格蛋白連接于肌原纖維的Z線，使鄰近的肌原纖維彼此連接，起到動力傳導作用。同時把肌原纖維與細胞核、肌膜下細胞骨架和胞漿內的細胞器連接，起到細胞內信號傳導作用。目前，Desmin在肌病、肌源性腫瘤研究較多，而在惡性腫瘤方面研究不是很多，朱雪瓊等［3］研究發現Desmin在子宮內膜間質肉瘤較富于細胞平滑肌瘤之間差異有高度顯著性，在子宮內膜間質肉瘤中表達較富于細胞平滑肌瘤降低；張汝玲等［4］研究發現在胰腺癌組織中Desmin表達呈強陽性；Cheng Wu等［5］通過雙向凝膠電泳與質譜技術發現，Desmin在胃癌較癌旁組織中表達增加；Ma，LY［6］通過雙向凝膠電泳和質譜技術在篩選大腸癌腫瘤標志物時發現Desmin在大腸癌中表達增加。本研究采用蛋白質組學技術中的液質聯用技術檢測了Desmin蛋白在大腸癌組織與癌旁組織中的表達情況。研究發現Desmin蛋白在大腸癌組織中的表達顯著低于癌旁組織，提示Desmin低表達與大腸癌癌變有關。盡管有關Desmin的研究結果存在分歧，但都說明了Desmin在腫瘤發生中起一定的作用，具體機制目前還不清楚，因此，Desmin蛋白在惡性腫瘤的發生機制仍需要進一步深入的研究。

［1］Weitz J，Koch M，Debus J，et al.Colorectal cancer［J］.Lancet，2005，365（9454）：153.

［2］Sharma S，Mücke N，KatusHA，et al.Disease mutations in the“head”domain of the extra－sarcomeric protein desmin distinctly alter its assembly and network－forming properties［J］.J Mol Med，2009，87（12）：1207.

［3］朱雪瓊，石一夏，趙承洛.子宮內膜間質肉瘤特異性標志物的研究［J］.現代婦產科進展，2003，12（5）：354.

［4］張汝玲，王興鵬，吳 愷，等.胰腺星狀細胞在胰腺癌組織中的激活及其可能作用［J］.胰腺病學，2002，2（1）：45.

［5］WU C，LUO ZW，CHEN XY，et al.Two－dimensional differential in－gel electrophoresis for identification of gastric cancer－specific protein markers［J］.Oncology Reports，2009，21：1429.

［6］Ma LY，Peng JY，Liu WJ，et al.Proteomics Identification of Desmin as a Potential Oncofetal Diagnostic and Prognostic Biomarker in Colorectal Cancer［J］.Molecular and Cellular Proteomics？，2009，8：1878.