缺氧對巨噬細胞HMGB1釋放的影響及其機制

李 蕾，韓菲菲，王發龍，劉 潔，陳國千＊

（1.南京醫科大學附屬無錫人民醫院 醫學檢驗科，江蘇 無錫214023；2.南京醫科大學附屬無錫人民醫院 呼吸科）

氧是人體各種細胞維持正常代謝活動所必需的。免疫細胞在人體免疫應答過程中發揮重要作用，且常處于病理性或生理性缺氧環境中。在諸多病理情況下，如感染、炎癥、創傷、休克、腫瘤、器官移植等，常發生缺氧［1］。缺氧可以明顯影響免疫細胞的多種生物學功能，如基因表達、炎癥反應、細胞分化、凋亡、能量代謝等。缺氧能誘導免疫細胞炎癥介質如白細胞介素（IL）、腫瘤壞死因子（TNF）等炎癥介質的釋放。高遷移率族蛋白B1（HMGB1）為近年發現的一種重要晚期炎癥介質，與膿毒癥、關節炎、急性胰腺炎、肺炎、腫瘤、缺血再灌注損傷、燙傷等發病機制關系密切［2］。許多研究顯示，巨噬細胞受脂多糖、TNF、生物活性脂等誘導后，胞內HMGB1可主動分泌到細胞外［3，4］，但缺氧是否誘導巨噬細胞釋放HMGB1尚未見研究報道。

1 材料與方法

1.1 材料

巨噬細胞株RAW264.7購自中國科學院細胞庫，缺氧培養箱為長沙華曦電子科技有限公司生產的YCP－50S三氣培養箱，使用99.99%N2。RPMI－1640、OPTI－MEMⅠ培養液為Gibco公司產品，胎牛血清為杭州四季青公司產品，N－乙酰半胱氨酸（NAC）、臺盼藍為Sigma公司產品，兔抗 HMGB1多克隆抗體為Gene Tex公司產品，熒光素FITC標記羊抗兔IgG為北京博奧森公司產品，RNAiso Plus、Prime Script RT Master Mix、Prime Ex Taq為Takara公司產品。

1.2 細胞培養實驗

巨噬細胞株RAW264.7使用RPMI－1640培養液（含10%胎牛血清、100U／ml青霉素、100μg／ml鏈霉 素、2mmol／L 谷氨 酰 胺）在37℃、5%CO2、95%空氣培養箱中進行常規培養，細胞貼壁覆蓋80%－90%時，換用無血清OPTI－MEM I培養液并洗滌2次，隨后進行細胞實驗。對照組繼續置于37℃、5%CO2、95%空氣培養箱中培養，缺氧組置于三氣培養箱中培養，培養氣體設置為5%CO2、1%O2、94%N2。細胞培養液收集后離心取上清液檢測HMGB1含量。各組實驗均重復6次。通過臺盼藍細胞染色顯示，巨噬細胞株RAW264.7經缺氧培養24h或100mmol／L NAC作用后細胞存活率無明顯改變。

1.3 HMGB1濃度測定

細胞培養上清液中HMGB1濃度采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測。HMGB1ELISA試劑盒為日本Shino－Test公司產品，按產品使用說明書進行分析定量。

1.4 HMGB1mRNA表達檢測

采用實時熒光定量PCR法檢測。按Trizol說明書提取細胞總RNA，紫外分光光度計測定其濃度和純度。根據Prime Script RT Master Mix試劑盒說明書進行逆轉錄反應，反應總體系10μl，反應條件37℃15min，85℃5sec，cDNA產物置－20℃保存。HMGB1、GAPDH引物和探針由Takara公司合成，見表1。PCR循環參數為95℃預變性30sec，95℃變性5sec，56℃退火15sec，72℃延伸20sec，循環40次。以HMGB1和GAPDH的Ct值之差（△Ct）作為HMGB1mRNA相對表達水平的指標。

表1 HMGB1、GAPDH的引物及探針序列

1.5 HMGB1細胞免疫熒光染色

培養巨噬細胞以4%甲醛固定10min，0.3%Triton X－100（pH 7.4）處理15min，10%牛血清白蛋白室溫封閉1h，然后分別與兔抗HMGB1多克隆抗體和FITC標記羊抗兔IgG37℃孵育1h，加甘油緩沖液、封片，以熒光顯微鏡觀察。

1.6 統計學分析

使用SPSS 18.0統計軟件包，兩組間比較采用雙側t檢驗分析，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 缺氧對巨噬細胞HMGB1釋放的影響

巨噬細胞株RAW264.7經缺氧（1%O2）培養12h、24h后，培養上清液中HMGB1含量明顯升高（P＜0.01），分別為對照組的4.0和5.4倍，見表2。

表2 缺氧對RAW264.7巨噬細胞培養上清液中HMGB1含量的影響（μg／L，±s）

表2 缺氧對RAW264.7巨噬細胞培養上清液中HMGB1含量的影響（μg／L，±s）

注：與對照組比較，＊P＜0.01；各組各時間點n＝62.

細胞培養時間6h 12h 24h對照組組別1.34±0.47 2.66±0.50 4.27±1.16缺氧組 1.90±0.51 10.75±1.99＊ 23.15±3.79＊

2.2 缺氧對巨噬細胞HMGB1mRNA表達的影響

巨噬細胞株RAW264.7經缺氧（1%O2）培養6 h、12h和24h后，細胞HMGB1mRNA表達水平逐漸增強（P＜0.01），且均明顯高于各自對照組（P＜0.05或P＜0.01），見表3。

表3 缺氧對RAW264.7巨噬細胞HMGB1mRNA表達的影響（△Ct，±s）

表3 缺氧對RAW264.7巨噬細胞HMGB1mRNA表達的影響（△Ct，±s）

注：與對照組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；各組各時間點n＝6

6h 12h 24h對照組組別5.92±0.35 5.79±0.41 6.02±0.30缺氧組 5.34±0.47＊ 4.20±0.28＊＊ 2.91±0.18＊＊

2.3 缺氧對巨噬細胞HMGB1核漿轉移的影響

HMGB1細胞免疫熒光染色顯示，對照組（普通培養）HMGB1主要定位于細胞核，而缺氧培養12h后，細胞核HMGBl特異性染色明顯變淡，胞漿染色加深，見圖1。

圖1 RAW264.7巨噬細胞HMGB1免疫熒光染色

2.4 NAC對缺氧誘導巨噬細胞HMGB1釋放的抑制作用

10mmol／L和100mmol／L的NAC對巨噬細胞株RAW264.7缺氧培養24h后培養上清液中的HMGB1含量顯示明顯抑制作用（P＜0.01），且100 mmol／L NAC的抑制作用明顯強于10mmol／L NAC（P＜0.05），呈劑量依賴性，但0.1mmol／L和1mmol／L NAC的抑制作用不明顯（P＞0.05），見圖2。

圖2 NAC對RAW264.7巨噬細胞缺氧釋放HMGB1的影響

3 討論

高遷移率族蛋白（HMG）為一類核內非組蛋白，因其在聚丙烯酰胺凝膠電泳中遷移速度快而得名。HMG包括 HMGA、HMGB、HMGN 3個家族，而HMGB家族有3個成員即 HMGB1、HMGB2、HMGB3。HMGB1在哺乳動物中高度保守，其氨基酸序列同源性在人和嚙齒類動物間高達99%。HMGB1由215個氨基酸組成，相對分子質量為30×103。HMGB1最初被認為是染色質的結構成分，功能局限在核內，主要參與穩定核小體的結構、調節基因轉錄、參與DNA修復、DNA重組及調控類固醇激素等生命活動。1999年，Wang等［3］發現HMGB1可以釋放到胞外并介導炎癥反應，為內毒素血癥和膿毒癥的重要炎癥介質。

HMGB1可以在細胞因子如IL－1、TNF－α、干擾素－γ（IFN－γ）、脂多糖及生物活性脂等因素刺激下，由單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、內皮細胞等主動分泌；也可由壞死細胞或受損細胞被動釋放。諸多研究［2］表明，炎癥介質HMGB1參與許多疾病的病理過程，如膿毒癥、關節炎、肺炎、腫瘤、缺血再灌注損傷、燙傷等。

缺氧可以明顯影響免疫細胞的多種生物學功能如炎癥反應等。研究［5］顯示，缺氧可誘導免疫細胞釋放TNF－α、IL－1等多種細胞因子或生物活性介質，參與炎癥反應。Acosta－Iborra等［6］報道，小鼠腹腔巨噬細胞在缺氧條件下培養可以產生高水平的IFN－γ、IL－12mRNA 及其蛋白表達，而抗炎性細胞因子IL－10mRNA水平保持不變；Thobe 等［7］報道，缺氧可致枯否（Kupffer）細胞IL－6和單核細胞趨化蛋白－1的生成釋放增加，其IL－6增加機制與通過Src介導的p38MAPK活化有關。近年有個別報道［8，9］顯示，缺氧（1%O2）可誘導肝細胞釋放HMGB1，且為非死亡被動釋放，呈時間依賴性，24h達到高峰；分離的新生心細胞在缺氧（1.5%O2）培養下合成和釋放HMGB1增加，12h達到高峰，而在常氧（21%O2）下培養至24h，HMGB1表達仍無明顯的變化。缺氧對巨噬細胞HMGB1釋放的誘導作用尚未見研究報道。本實驗以缺氧作為刺激因素，研究其對巨噬細胞HMGB1釋放的影響。臺盼藍染色法檢測顯示缺氧24h以內對細胞生存率無明顯影響，各組細胞存活率均在95%以上，因而排除了細胞壞死發生的HMGBl被動釋放。本研究發現，巨噬細胞株RAW264.7經缺氧誘導12h后培養上清液HMGB1蛋白水平明顯升高，24h后釋放達到高峰，細胞免疫熒光染色觀察發現HMGBl出現核漿轉移。因蛋白質的表達受多級水平的調控，如轉錄水平、翻譯水平調控等，所以我們同時測定了HMGB1mRNA的表達水平，結果顯示，缺氧6h時HMGB1mRNA表達已顯示增強，表明缺氧誘導HMGB1分泌增加與轉錄水平調控有關。

有研究顯示，將細胞置于缺氧環境中數小時后，通過二氯熒光黃雙乙酸鈉（DCFH－DA）熒光標記法測定的細胞內活性氧自由基（ROS）含量增加［10］。NAC作為一種巰基供給體，具有清除自由基、抗氧化劑等作用，本研究使用NAC進行細胞干預實驗，結果顯示10、100mmol／L的NAC對缺氧誘導巨噬細胞HMGB1釋放具有明顯的抑制作用，與Tsung等［8］使用肝細胞的研究結果基本一致，提示缺氧誘導細胞HMGB1釋放可能與胞內ROS產生有關。缺氧誘導HMGB1釋放是否涉及其它氧依賴相關信號通路等還有待進一步研究。

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