轉染CTGF基因對乳腺癌細胞MMP-2及TIMP-2表達的影響

許斌，陳寅，戴桂紅，蔣小芹，王薇，趙國軍，于鴻

(泰州市人民醫院1.普外科，2.病理科，江蘇 泰州225000)

結締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)是新發現的CCN家族成員，在人類多種組織器官中廣泛表達，具有促進細胞增殖、介導細胞黏附、刺激細胞遷移、促進血管生成等生物學功能［1］。近年來的研究顯示CTGF的表達水平與多種惡性腫瘤的發生進展、浸潤轉移、腫瘤血管生成及預后密切關聯［2］。CTGF基因在惡性腫瘤中的作用已引起了越來越多研究者的重視，但目前對CTGF基因在乳腺癌發生、發展過程中的具體機制并不十分明了。本實驗采用細胞轉基因技術，將CTGF cDNA經脂質體介導轉染人乳腺癌MCF-7細胞株，觀察轉基因細胞克隆基質金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)及基質金屬蛋白酶組織抑制因子-2(tissue inhibitor of metalloproteinase-2，TIMP-2)的表達及該克隆細胞增殖的改變，以進一步探討CTGF對乳腺癌的作用機制，為今后對乳腺癌患者實施針對性基因治療提供理論和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料

人乳腺癌MCF-7細胞株購于中國科學院上海細胞生物研究所;DMEM、胎牛血清及無血清培養液購于Gibco BRL公司;OneStep RT-PCR Kit購于Qiagen公司;Trizol試劑及Lipofectamine 2000轉染試劑盒購于Sigma公司;鼠抗人MMP-2單克隆抗體及鼠抗人TIMP-2單克隆抗體購于 Dako公司;羊抗人CTGF多克隆抗體及兔抗羊FITC-IgG購于Santa Cruz公司;ABC試劑盒購于Vector公司。PCR引物由上海英駿生物技術有限公司合成。

1.2 脂質體介導瞬時轉染CTGF基因

pcDNA3.0-CTGF真核表達質粒由臺北大學Min-liang Kuo博士饋贈，經本實驗室常規方法酶切鑒定［3］，送測序(聯合基因公司)后擴增。人乳腺癌MCF-7細胞株培養按本實驗室常規方法進行［4］。轉染前1 d，MCF-7細胞以2×106個/孔傳至6 cm培養皿內;12 h后，棄完全培養液，分別加入含有Lipofectamine 2000和CTGF真核表達質粒或脂質體和空載體pcDNA3.1混合物的無血清培養液4 ml;6 h后棄無血清培養液，改用10%胎牛血清完全培養液。

1.3 免疫熒光法檢測CTGF蛋白的表達

轉染結束后，冷丙酮固定細胞15 min，一抗為羊抗人多克隆抗體(1∶100)，二抗為兔抗羊FITC-IgG(1∶50)。熒光顯微鏡下觀察細胞內熒光分布，并拍照記錄。

1.4 RT-PCR法檢測MCF-7細胞CTGF mRNA

轉染MCF-7細胞，Trizol抽提總RNA，按照Qiagen公司試劑盒說明書提供的步驟在PCR儀上進行擴增反應。反應條件:50℃逆轉錄30 min，95℃滅活逆轉錄酶15 min，94℃變性2 min，60℃復性1 min，72℃延伸1 min，共33個循環。RT-PCR引物如下:內參照GAPDH上游5'-ACCACAGTCCATGCCATGCCATCAC-3';下游 5'-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3'，預計擴增片段長度為450 bp。CTGF上游5'-TGTGGAATGGGCATCTCC-3';下游5'-TTTCATGATCTCGCCATCG-3'，預計擴增片段長度為306 bp。MMP-2上游 5'-CTCAGCGGCTCATGGTCCGGCC-3';下游5'-CATGGTCCGGCCCCCGCCCCCA-3'，預計擴增片段長度為278 bp。TIMP-2上游5'-CTGTCCCCTCBCCTCTTCGC-3';下游5'-TCCACCTCCTTCTCGCTCACTG-3'，預計擴增片段長度為303 bp。

1.5 蛋白質印跡法檢測MMP-2和TIMP-2的表達

轉染MCF-7細胞，常規抽提總蛋白，依標準方法進行10%SDS-PAGE變性電泳，半干式電轉移至PVDF膜。一抗分別為羊抗人CTGF多克隆抗體(1∶200)，鼠抗人MMP-2單克隆抗體(1∶200)，鼠抗人TIMP-2單克隆抗體(1∶200)。二抗分別為生物素化兔抗羊IgG及生物素化兔抗鼠IgG(1∶400，上海長島公司)。

1.6 定量和統計分析

凝膠電泳用Kodak凝膠成像儀進行拍照記錄，Kodak圖像分析軟件測定條帶光密度值。應用SPSS 13.0軟件包對數據進行標準差(±s)計算和t檢驗。

2 結果

2.1 真核表達質粒pcDNA3.0-CTGF的鑒定

重組真核表達質粒pcDNA3.0-CTGF，測序結果顯示，與基因庫人CTGF序列 (GI∶325910844)完全一致。又經EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切及EcoRⅠ單酶切鑒定，結果顯示重組質粒構建正確無誤(圖1)。

圖1 重組質粒pcDNA3.0-CTGF的鑒定Fig 1 Confirming of recombinant plasmid pcDNA3.0-CTGF

2.2 轉染CTGF基因的MCF-7細胞免疫熒光法檢查

與 MCF-7及轉空載體的 MCF-7相比，轉染pcDNA3.0-CTGF的MCF-7，其胞質熒光亮度明顯增強(圖2)。

2.3 RT-PCR和蛋白質印跡法對轉基因MCF-7的鑒定

圖2 免疫熒光檢測CTGF蛋白表達(FITC標記×200)Fig2 Immunofluorescence for detecting CTGF protein

RT-PCR結果表明，與空載體MCF-7細胞相比，轉染CTGF的MCF-7細胞CTGF mRNA表達水平明顯升高(t=8.264，P ＜0.01)(圖 3);蛋白質印跡結果表明，轉CTGF的MCF-7細胞CTGF蛋白表達水平也明顯升高(t=9.387，P ＜0.01)，顯示相對分子質量為38 000蛋白條帶(圖4)。該結果表明，經脂質體介導的上述基因轉染是成功的。詳見表1。

圖3 RT-PCR法檢測轉染細胞CTGF mRNA的表達Fig 3 RT-PCR analysis for detecting CTGF mRNA

圖4 蛋白質印跡法檢測CTGF蛋白表達Fig 4 Western blot analysis for detecting CTGF protein

表1 各組細胞CTGF mRNA和蛋白表達的變化ˉx ± s，n=5Tab1 The expressions of CTGF mRNA and protein in different groups

2.4 轉基因MCF-7 MMP-2和TIMP-2蛋白的表達

蛋白質印跡結果顯示，與轉染空載體MCF-7相比，轉染CTGF的MCF-7細胞MMP-2蛋白表達顯著增加(t=13.145，P ＜0.01)，顯示相對分子質量為92 000蛋白條帶(圖5);MCF-7與轉染空載體MCF-7之間，差異無統計學意義(t=2.248，P ＞0.05)。與轉染空載體 MCF-7相比，轉染 CTGF的MCF-7 TIMP-2蛋白表達顯著降低(t=11.852，P ＜0.01)，顯示相對分子質量為21 000蛋白條帶(圖6);MCF-7與轉染空載體MCF-7之間，差異無統計學意義(t=3.196，P ＞0.05)。詳見表2。

圖5 蛋白質印跡法檢測MMP-2蛋白表達Fig 5 Western blot analysis for detecting MMP-2 protein

圖6 蛋白質印跡法檢測TIMP-2蛋白表達Fig 6 Western blot analysis for detecting TIMP-2 protein

3 討論

深入闡明乳腺癌侵襲和轉移的分子機制，對于尋找新的干預靶點，為乳腺癌的治療提供新的線索具有重要意義。自從結締組織生長因子于臍周靜脈內皮細胞中首次發現后，其逐步成為器官纖維化領域的研究熱點之一，但越來越多的研究顯示，CTGF在腫瘤的形成與發展過程起著重要的作用，因此有望成為乳腺癌基因治療的有效靶點之一。Bennewith等［5］報道，CTGF的高表達與胰腺癌、食管癌、膠質瘤、乳腺癌、胃癌、宮頸癌等患者的預后差密切相關，其機制可能為腫瘤細胞自身產生的CTGF可促進該腫瘤細胞的生長。Chen等［6］發現，CTGF通過整合素-細胞外信號調節蛋白激酶(Integrin-ERK)信號通路促進乳腺癌細胞侵襲、轉移。Aikawa等［7］報道，乳腺癌中CTGF mRNA表達水平增高，可顯著增強癌腫侵襲與轉移能力，并顯著縮短患者生存時間。這些研究結果提示，CTGF在乳腺癌的進展過程中起著重要的作用，CTGF在乳腺癌組織中的高表達提示乳腺癌患者預后差。

表2 各組細胞MMP-2及TIMP-2蛋白表達的變化ˉx ± s，n=5Tab 2 The expressions of MMP-2 and TIMP-2 protein in different groups

大量研究證實，細胞外基質(extracellular matrix，ECM)和基底膜的降解和破壞是腫瘤侵襲、轉移過程中的重要環節，而這些組織結構的破壞和降解需要相應的基質溶解酶參與。基質溶解酶系統由一個龐大的蛋白溶解酶家族組成，也稱基質金屬蛋白酶系統，包括MMPs及相應抑制劑TIMPs。MMP-2作為基質金屬蛋白酶系統重要成員之一，通過降解和破壞ECM中的Ⅳ型膠原和明膠，利于腫瘤內血管的形成與生長，與多種惡性腫瘤的侵襲和轉移關系極為密切［7］。TIMP-2是MMP-2組織抑制因子，能抑制MMP-2活性，MMP-2/TIMP-2表達失衡將促進腫瘤的侵襲和轉移，并且TIMP-2表達增加往往與腫瘤侵襲能力下降及患者的預后較好相關［8］。本實驗為探討CTGF在乳腺癌侵襲和轉移中的作用機制，采用細胞轉基因技術，獲得穩定高表達CTGF的乳腺癌細胞克隆，與對照組相比，該細胞克隆MMP-2表達增加，而TIMP-2表達降低，提示CTGF參與MCF-7細胞MMP-2及TIMP-2的合成代謝過程，并通過上調MMP-2的表達及下調TIMP-2的表達而促進乳腺癌侵襲與轉移。然而，對于CTGF參與促進惡性腫瘤的生長、侵襲及轉移的作用機制還遠未闡明。近年來，一些研究發現除TGF-β/Smad信號通路可調節 CTGF的表達，絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、ERK和C-Jun N末端激酶(JNK)與CTGF信號通路之間存在相互作用或相互串話(crosstalk)［9］。Kwon 等［10］報道，ras/MAP-ERK 信號通路依賴Smad4而顯著上調乳腺癌細胞CTGF的表達。這些實驗結果提示我們，在今后進一步研究乳腺癌發生機制以及CTGF所起作用時，還必須加強CTGF信號通路與其他信號通路之間的相互關系的實驗研究，才能從本質上闡明其發生機制，從而有可能探索出更具有針對性和有效性的治療策略和方法。

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［4］許斌，肖蔚，焦霞，等.生存素反義寡核苷酸對乳腺癌MCF-7細胞株MMP-2及MMP-9表達的影響［J］.江蘇大學學報:醫學版，2011，21(3):203 －207.

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