七厘散促小鼠觸須部創面修復及部分機制探討＊

劉愛軍 易 華 杜標炎 廣州中醫藥大學基礎醫學院（廣州510006）

皮膚覆蓋在人體表面，日常生活中極易發生創傷。中醫中藥治療皮膚損傷歷史悠久，療效確切。七厘散（Qili San）是著名的傷科要藥，至今仍在臨床廣為應用，但是由于中藥中成分復雜，其促進皮膚愈合的機制目前尚未完全明了，本文主要研究七厘散在小鼠觸須部皮膚缺損修復中的作用，并初步探討了七厘散含藥血清對皮膚成纖維的促增殖作用，為進一步研究七厘散促進皮膚干細胞的增殖和分化奠定實驗基礎。

1 材料與方法 1.1 實驗動物 雄性昆明小鼠，出生后約4w，質量20～25g，購自本校實驗動物中心（質量合格證編號：SCXK（粵）2008－0020）。

1.2 主要試劑 七厘散購自北京同仁堂制藥廠，批號：0100006；無菌生理鹽水、醫用酒精、無菌棉簽均購自廣州中醫藥大學保健科；外用噴劑金因肽購自廣州紅十字會醫院，產品批號：2009－08－08，含表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）2000IU／mL；梯度酒精、二甲苯、HE染料、中性樹膠均為基礎醫學院技術室提供。高糖DMEM培養基（Gibco公司）；胎牛血清（FBS，天津灝洋生物制品科技有限公司）；25cm2塑料培養瓶（Coning公司）；胰蛋白酶（Sigma公司），余試劑均為國產分析純。

1.3 實驗儀器 德國TP1020組織脫水機；德國EG1160石蠟包埋機；德國LeicaRM2135輪轉切片機；德國HI1220攤片機；德國ET4040染色機；防脫玻片及蓋玻片購自博士德生物試劑公司；日本OLYMPUS光學顯微鏡。

1.4 實驗方法 1.4.1 七厘散促小鼠觸須部皮膚修復的作用：無菌條件下剪去昆明雄小鼠雙側觸須部表皮，保留真皮，隨機分為5組，每組20只，分別進行以下處理：實驗對照組創面涂以生理鹽水；陽性藥物對照組以金因肽均勻噴濕創面，約4000IU／mL×10cm2；七厘散內服組以120mg／mL七厘散混懸液、按0.2mL／10g灌胃，七厘散外用組以20%龍血竭混懸液、按24mg／cm2涂于觸須部創面；七厘散內服＋外用組以上述內服、外用劑量同時應用，以上各組每日定時處理1次，連續觀察各組動物7d創面愈合情況。術后1d、3d、5d、7d取觸須創面，每組每次5只小鼠，行常規病理學組織切片，HE染色，片厚2μm，顯微鏡下觀察各組標本改變。

1.4.2 七厘散含藥血清的制備：雄性昆明小鼠，質量20～25g，七厘散劑量為等效劑量的20倍，無菌生理鹽水混勻，每天灌胃2次，間隔12h，連續7d，第8日禁食不禁水，上午灌胃2次，間隔2h，于末次灌胃后1h斷頭取血，所取全血室溫下靜置2～3h，3000r／min離心10min，分離血清，將所有血清混合；56℃、30min滅活；0.2μm 濾膜過濾除菌；－70℃保存備用。

1.4.3 小鼠皮膚成纖維細胞的分離培養：孕齡12.5d～14.5d昆明小鼠處死后，無菌條件下取出胚胎，去除胚胎頭、四肢和內臟，剪碎軀干部分組織，加入2.5g／L胰蛋白酶消化1min，用含血清的培養基中止消化，離心，棄上清，用培養基重新懸浮組織，將組織接種入25cm2培養瓶，5%CO2、37℃靜置培養，4～6d原代細胞長滿，常規消化傳代，調整P3代細胞濃度，以8000個／孔接種于96孔板，細胞饑餓24h后進行實驗。

1.4.4 MTT法檢測七厘散含藥血清對小鼠皮膚成纖維細胞增殖的影響：高糖DMEM含總血清20%，其中含七厘散含藥血清分別為0%、2.5%、5%、10%、20%五個濃度梯度，余血清以胎牛血清補足血清總體積為20%，用作用于96孔板中培養的胎鼠皮膚成纖維細胞，24h后MTT法檢測不同條件下胎鼠皮膚成纖維細胞的生長曲線，無血清DMEM作為空白對照，尋找能顯著促進細胞生長的七厘散含藥血清體積百分比。

2 結 果 2.1 各組動物創面大體觀察 術后1d，七厘散內服＋外用組各組動物創面無出血，呈暗紅色，約有一半出現結痂，其余各組動物創面無出血，呈暗紅色，無結痂。術后2d，陽性藥物對照組、七厘散內服＋外用組已全部結痂；其余各組亦出現結痂。術后3d，除實驗對照組外其余各組動物創面全部結痂。術后5d，陽性藥物對照組、七厘散內服＋外用組已出現痂皮脫落，新生表皮平滑、有光澤、色淡。術后6d，其余各組開始痂皮脫落。術后7d，各組小鼠觸須部創面基本痊愈。

2.2 各組動物創面病理學改變 術后1d，各組鏡下可見大量滲出紅細胞、炎細胞（圖1），七厘散內服＋外用組紅細胞滲出少，炎性反應較輕（圖2）。術后3d，各組動物創面炎性細胞浸潤均減少（圖3）；七厘散內服＋外用組、陽性藥物對照組創面可見有表皮細胞、成纖維細胞增生（圖4）。術后5d，各組可見表皮細胞、成纖維細胞增生，表皮細胞和膠原纖維排列疏松紊亂（圖5），七厘散內服＋外用組成纖維細胞增生明顯，膠原纖維合成和分泌增加，真皮層較致密，新生表皮較厚，細胞分層明顯（圖6）。術后7d，創面基本修復，七厘散內服＋外用組表皮細胞分層明顯，真皮致密，表皮－真皮連接緊密（圖7），其余各組表皮－真皮連接有局部不牢固（圖8）。

圖1 實驗對照組小鼠觸須部創面術后1d，炎性細胞浸潤明顯，滲出紅細胞較多HE染色 ×400

圖2 七厘散內服＋外用組小鼠觸須部創面術后1d，炎性細胞浸潤少，滲出紅細胞少 HE染色 ×400

圖3 實驗對照組小鼠觸須部創面術后3d，炎性細胞浸潤明顯減少HE染色 ×400

圖4 七厘散內服＋外用組小鼠觸須部創面術后3d，創面表皮細胞、成纖維細胞開始增生 HE染色 ×400

圖5 實驗對照組小鼠觸須部創面術后5d，表皮細胞、成纖維細胞增生，膠原纖維排列疏松紊亂 HE染色 ×400

圖6 七厘散內服＋外用組小鼠觸須部創面術后5d，新生表皮明顯，成纖維細胞、膠原纖維增多 HE染色 ×400

圖7 七厘散內服＋外用組小鼠觸須部創面術后7d，新生表皮明顯，真皮致密，表皮－真皮連接緊密 HE染色 ×400

圖8 實驗對照組小鼠觸須部創面術后7d，新生表皮－真皮局部連接欠佳 HE染色× 400

2.3 MTT測定七厘散含藥血清對小鼠皮膚成纖維細胞增殖的影響

圖9 七厘散含藥血清對小鼠皮膚成纖維細胞增殖的影響104個／孔

討 論 皮膚位于身體表面，直接與外界環境相接觸，皮膚創傷是臨床上的常見病與多發病，如何快速有效地促進皮膚創面的愈合、防止各種嚴重并發癥有著重要的臨床意義。

祖國傳統醫學認為皮膚創傷后創面形成血瘀證［1］，治療上遵循“活血化瘀”、“祛瘀生肌”、“偎膿長肉”等治則，療效確切，使用方便，毒副作用小［2］。七厘散出自《良方集腋》，七厘散又名“傷科七厘散”、“神效七厘散”、“臺麝七厘散”，是著名的傷科常用中成藥。

本研究結果提示，七厘散對小鼠觸須部皮膚創面有抗炎作用，并促進痂皮形成，痂皮的形成時間較傷科常用龍血竭提早約1d［3］，痂皮形成對創面早期愈合具有積極地意義，阻止外界微生物入侵，防止機體水分及營養物質丟失，能防止機械刺激對創面造成二次損害。七厘散為經典傷科復方，其組成為：血竭、乳香、沒藥、朱砂、冰片、當歸、紅花、麝香、兒茶。方中血竭、紅花、當歸活血祛瘀、生肌，乳香、沒藥行氣散血、消腫止痛，冰片清熱生肌止痛，兒茶清熱定痛生肌、斂創止血，其抗炎生肌的效果優于單味藥龍血竭。金因肽的有效成分為EGF，EGF雖亦能促進成纖維細胞及表皮細胞增殖，但EGF在體內的半衰期極短，無法保持長期有效濃度。同時，我們還證實七厘散含藥血清能顯著促進體外培養的小鼠皮膚成纖維細胞的增殖。成纖維細胞在皮膚愈合中具有重要作用，其能合成和分泌Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、FN等細胞外基質成分并參與形組成肉芽組織，肉芽組織不僅能填充皮膚缺損，亦能促進表皮細胞沿著創面周緣向中央遷移；成纖維細胞分泌的bFGF、VEGF、EGF等細胞因子又能促進創面各種細胞的增殖，進而促進創面愈合［4，5］。本研究結果為進一步深入研究七厘散促進皮膚細胞增殖的有效成分及其促進的分子機制奠定重要的實驗基礎。

［1］蔣 森.血瘀論［M］.北京：中國醫藥科技出版社，2001：33－34，55.

［2］陳可冀，李連達，翁維良，等.血瘀證與活血化瘀研究［J］.中西醫結合心腦血管病雜志，2005，3（1）：1－2.

［3］劉愛軍，易 華，杜標炎.龍血竭對小鼠觸須部毛囊干細胞增殖和分化的影響［J］.陜西中醫，2011，32（8）：1089－1092.

［4］刑 捷，闞華發，唐漢均.中醫藥促進皮膚潰瘍創面肉芽組織生長的實驗研究近況［J］.中西醫結合學報，2008，6（10）：1080－1085.

［5］易成剛，郭樹中，陳建宗.生肌類中藥的理論與實驗研究［J］.中國臨床康復，2004，8（29）：6470－6471.