HPLC法測(cè)定乳癖散結(jié)顆粒中迷迭香酸的含量

王云霞 王敏春 謝志民 西安市食品藥品檢驗(yàn)所（西安710054）

乳癖散結(jié)顆粒是國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局2008年批準(zhǔn)生產(chǎn)的新劑型，由夏枯草、川芎、僵蠶、鱉甲、柴胡、赤芍、玫瑰花、莪術(shù)、當(dāng)歸、延胡索、牡蠣等11味藥材組成，原標(biāo)準(zhǔn)無(wú)含量控制方法。夏枯草為方中君藥，以往資料多采用高效液相色譜法、氣相色譜法、薄層掃描法或毛細(xì)管電泳法測(cè)定其齊墩果酸或熊果酸的含量，作為其質(zhì)量控制方法；近年來(lái)有以高效液相色譜法測(cè)定其迷迭香酸的含量，作為其質(zhì)量控制方法［1－3］，均使用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑。本文使用極性乙醚連接苯基鍵合硅膠柱，采用HPLC方法測(cè)定其所含迷迭香酸的含量，作為成方制劑的質(zhì)量控制方法。

1 儀器與試藥 1.1儀器 島津LC－2010AHT型高效液相色譜儀、LC－solution色譜工作站，北京普析通用分析儀器有限責(zé)任公司TU－1800PC型紫外－可見分光光度計(jì)。

1.2 試劑與試藥 迷迭香酸對(duì)照品由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供（批號(hào)：111871－201001，供含量測(cè)定用），乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為雙蒸水，乳癖散結(jié)顆粒樣品為陜西白鹿制藥股份有限公司提供，陰性樣品、模擬低濃度樣品、模擬高濃度樣品均自制。

2 方法與結(jié)果 2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) Phenomenex Synergi極性乙醚連接苯基鍵合硅膠柱（4μm，250mm×4.60mm），柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為330nm，流速1.0mL／min－1，采用乙腈－0.1%磷酸梯度洗脫，時(shí)間程序見下表。

表1 時(shí)間程序表

在此條件下，樣品得到良好分離，二極管陣列檢測(cè)結(jié)果證明樣品峰紫外吸收與對(duì)照品峰一致，夏枯草陰性對(duì)照樣品在迷迭香酸峰處無(wú)峰出現(xiàn)，不干擾本品的測(cè)定。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取迷迭香酸對(duì)照品10.01mg，置25mL量瓶中，加甲醇使溶解，并加至刻度，搖勻，作為6號(hào)對(duì)照品溶液，精密吸取6號(hào)對(duì)照品溶液1mL 5份，分別置5mL、10mL、25mL、50mL和100mL量瓶中，加乙腈－0.1%磷酸（20：80）的混合溶液至刻度，搖勻，分別作為5～1號(hào)對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液制備 取重量差異項(xiàng)下的本品，研細(xì)（過(guò)3號(hào)篩），精密稱取粉末2g，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇－甲酸（100：3.5）的混合溶液25mL，稱定重量，加熱回流1h，放冷，再稱定重量，用上述混合溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，置冰箱中冷藏2h，取出，濾過(guò)，棄去初濾液，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍 按2.1中方法，精密吸取1～6號(hào)對(duì)照品溶液10μL（6號(hào)增加一15μL，1號(hào)增加一5μL），各進(jìn)樣2次，測(cè)定峰面積。以峰面積平均值為縱坐標(biāo)，以進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，計(jì)算得回歸方程 Y＝3E＋06X－7110.2，r＝0.99992，表明在該系統(tǒng)條件下，迷迭香酸進(jìn)樣量在0.02ug～6.0ug范圍內(nèi)，峰面積積分值與進(jìn)樣量呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取2.2項(xiàng)1、3、5號(hào)對(duì)照品10uL，各進(jìn)樣5次，按上述條件測(cè)定峰面積，結(jié)果RSD均小于1%。表明本方法進(jìn)樣量在0.04ug～0.8ug范圍內(nèi)進(jìn)樣精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取模擬1號(hào)樣品（低濃度）、050828號(hào)樣品和模擬2號(hào)樣品（高濃度）2g，各3份，共9份，按照2.3項(xiàng)方法制備供試品溶液。精密吸取各供試品溶液和2.2項(xiàng)下2、3、5號(hào)對(duì)照品溶液各10μL，注入液相色譜儀，按2.1項(xiàng)下的條件測(cè)定迷迭香酸色譜峰面積，計(jì)算，結(jié)果表明樣品每袋含迷迭香酸在0.45mg～3.96mg范圍內(nèi)，測(cè)定結(jié)果的RSD為0.2%～1.27%。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取2.6中批號(hào)為050828的供試品溶液，按2.1項(xiàng)下方法，分別于0h、2h、4h、8h、12h、16h、20h和24h測(cè)定峰面積，結(jié)果峰面積RSD為0.43%，顯示供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 回收率試驗(yàn) 精密稱取迷迭香酸對(duì)照品12.02mg，置25mL量瓶中，加甲醇使溶解，并加至刻度，搖勻，作為Ⅰ號(hào)對(duì)照品溶液。精密吸取Ⅰ號(hào)對(duì)照品溶液3mL2份，分別置5mL和10mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，分別作為Ⅱ、Ⅲ號(hào)對(duì)照品溶液。分別精密稱取模擬1號(hào)樣品粉末、050828號(hào)樣品粉末、模擬2號(hào)樣品粉末1g，各3份，共9份，分別置具塞錐形瓶中。模擬1號(hào)樣品分別精密加入III號(hào)對(duì)照品溶液1mL、050828號(hào)樣品分別精密加入Ⅱ號(hào)對(duì)照品溶液1mL、模擬2號(hào)樣品分別精密加入Ⅰ號(hào)對(duì)照品溶液2mL，分別精密加入50%甲醇－甲酸（100：3.5）溶液各25mL，按2.3中方法制備供試品溶液，以2.1中條件測(cè)定含量，計(jì)算回收率，結(jié)果（見表2）表明每袋含迷迭香酸在0.45mg～3.96mg范圍內(nèi)平均加樣回收率為100.38%，RSD為1.35%～1.99%。

表2 迷迭香酸加樣回收實(shí)驗(yàn)（n＝9）

2.9 樣品含量測(cè)定 精密稱取6批樣品各2g， 按2.3中方法制備溶液，以2.1中條件測(cè)定含量，結(jié)果6批樣品含量為0.86mg／袋～1.71mg／袋（見表3），RSD為0.04%～1.04%。

表3 各批次測(cè)定情況表

3 討 論 3.1 研究過(guò)程中采用正交實(shí)驗(yàn)的方法對(duì)回流時(shí)間、甲酸的加入量等影響因素進(jìn)行了考察 結(jié)果表明，回流時(shí)間和甲酸加入量對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有顯著影響，以50%甲醇－甲酸（100：3.5）為提取溶劑，回流1h為最佳。

3.2 樣品溶液制備過(guò)程中發(fā)現(xiàn) 溶液放冷補(bǔ)重后直接濾過(guò)比較難，將此溶液置0～4℃冰箱中冷藏2h后較易濾過(guò)，不影響迷迭香酸的測(cè)定結(jié)果。

3.3 研究過(guò)程中同時(shí)對(duì)乳癖散結(jié)片和乳癖散結(jié)膠囊作了方法適用性研究 證明本法對(duì)乳癖散結(jié)片和乳癖散結(jié)膠囊中迷迭香酸的含量測(cè)定亦有良好的適用性。

3.4 系統(tǒng)耐用性試驗(yàn) 結(jié)果證明不同品牌的色譜柱、不同檢測(cè)波長(zhǎng)（326nm～334nm）、不同流動(dòng)相比例（乙腈占18%～20%）、不同柱溫（30℃～35℃）、不同流速（1.0mL／min～1.2mL／min）條件下迷迭香酸峰分離良好、峰形對(duì)稱，均可用于迷迭香酸的含量測(cè)定。

［1］國(guó)家藥 典委員會(huì).中國(guó)藥典［S］.一部.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010：197.

［2］王祝舉，趙玉英，王 頒，等.夏枯草中迷迭香酸含量分析方法研究［J］.藥物分析雜志，2006，26（3）：399.

［3］張?zhí)m珍，秦 雯，張小華，等.夏枯草不同部位中咖啡酸和迷迭香酸的含量測(cè)定方法研究［J］.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，5：9.