超高效液相色譜串聯質譜法快速測定乳及乳制品中三聚氰胺

胡強，王延云，李超豪，吳衛，向樂曦，楊春林

1(樂山市產品質量監督檢驗所，四川樂山，614000)2(樂山師范學院化學與生命科學學院，四川 樂山，614000)

三聚氰胺屬于三嗪類含氮雜環有機化合物，是一種化工原料，廣泛運用于塑料、涂料、造紙、紡織、皮革、電器、醫藥等行業。三聚氰胺含氮量高(66.6%)，因此，某些不法廠商為了降低生產成本，利用國家標準中采用凱氏定氮法只能檢測含氮量并不能鑒定其化學成分的缺陷［1］，在飼料中添加三聚氰胺或直接在乳及乳制品中添加三聚氰胺，提高食品檢測中蛋白質含量指標［2－4］。三聚氰胺被認為有輕微毒性，長期或反復大量攝入三聚氰胺將會造成生殖、泌尿系統的損害，膀胱、腎部結石，并可進一步誘發膀胱癌［5］。因此，乳及乳制品中三聚氰胺檢測方法的研究有著非常重要的意義。

目前，關于乳及乳制品中三聚氰胺的檢測方法有酶聯免疫吸附法(ELISA)［6］、氣相色譜-質譜聯用法(GC-MS)［7］、高效液相色譜法(HPLC)［8－9］和液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)［10－14］。由于乳及乳制品樣品基質復雜，ELISA易出現假陽性，且陽性樣品需進一步確證分析;GC-MS法前處理采用衍生化，操作過程繁瑣;HPLC和LC-MS/MS法前處理采用固相萃取凈化，試劑及耗材成本較高［15－17］。本研究選擇提取液經超聲波提取、液液萃取和稀釋，除去蛋白質、脂肪等雜質，利用UPLC-MS/MS法，建立快速、經濟、準確、靈敏的乳及乳制品中三聚氰胺的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳粉、液態乳、酸奶樣品市購。

三聚氰胺(純度99.5%)，購自德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司;乙腈、乙酸為色譜純，購自美國Tedia公司;0.22 μm微孔濾膜，購自美國Waters公司;二氯甲烷、乙酸銨、鹽酸，均為優級純。

1.2 儀器與設備

ACQUITY UPLC I-Class+Xevo TQD超高效液相色譜串聯質譜聯用儀(美國Waters公司)，配有FTN自動進樣器、BSM二元泵、CH-A柱溫箱、ESI電離源和MassLynxTM4.1工作站;Milli-Q Academic超純水裝置(美國Millipore公司);SG5200HPT超聲波清洗器(上海冠特超聲儀器有限公司);TG-20臺式高速離心機(四川蜀科儀器有限公司)。

1.3 色譜分析條件

色譜條件 色譜柱:ACQUITY UPLC BEH HILIC(2.1 mm ×75 mm，1.7 μm);流動相為 80% 乙腈和20%水;柱溫:40℃;進樣量:2μL;流速0.6 mL/min。

質譜條件ESI正離子檢測模式，毛細管電壓3.5 kV，萃取電壓3 V，離子源溫度150℃，脫溶劑溫度為550℃，脫溶劑氣和錐孔氣均為N2，脫溶劑氣流速600 L/h，錐孔氣流速50 L/h，碰撞氣為高純氬氣，碰撞室的壓力35MPa。采用多反應監測(MRM)模式，離子對駐留時間(dwell time)均為0.163 s，選擇離子監測條件，見表2。

表1 MRM監測模式下的監測條件

1.4 標準溶液的配制

標準儲備液:準確稱取0.100 0 g(精確到0.1 mg)三聚氰胺標準品于100 mL容量瓶中，用甲醇-水溶液(體積比1∶1)溶解并定容至刻度，配制成質量濃度為1 mg/mL的標準儲備液，于0～4℃下避光保存。

標準工作液:用基質空白溶液將三聚氰胺標準儲備液逐級稀釋，得到質量濃度為0.5～100 μg/L系列的標準工作液。

1.5 樣品前處理

準確稱取約0.5 g(精確至0.001 g)樣品于15 mL具塞塑料離心管中，加入10 mL乙腈-水溶液(體積比1∶1)，渦旋30 s，然后超聲提取 25 min，以8 000 r/min離心10 min，提取液轉入25 mL比色管中，加入150 μL HCl(1 mol/L)和10 mL二氯甲烷，閉塞震蕩20 min，然后以8 000 r/min離心10 min，取上清液1 mL加入4 mL乙腈稀釋，混勻后過0.22 μm濾膜，濾液供UPLC-MS/MS分析。

2 結果與分析

2.1 樣品前處理的選擇

乳及乳制品中主要含有蛋白質、脂肪等成分，本研究通過對選取提取液、超聲波提取、液液萃取和適當稀釋等前處理步驟的優化，盡可能降低基質效應、提高檢測重復性和靈敏度。三聚氰胺可溶于乙腈，乙腈，而它們具有沉淀蛋白質的作用，因而提取液選擇乙腈-水溶液，選取 V(乙腈)∶V(水)=8∶2、7∶3、6∶4、5∶5進行實驗。結果表明，在 V(乙腈)∶V(水)=5∶5時，三聚氰胺提取效率較高，且蛋白質等雜質沉淀效果較好;超聲波提取是為了增強提取液對樣品中三聚氰胺的提取效率，實驗發現，超聲波提取時間為25 min時，三聚氰胺提取效率最高，繼續延長超聲波提取時間并不能提高三聚氰胺提取效率;乳與乳制品樣品中至少含有3%的脂肪，使用二氯甲烷通過液液萃取除去樣品中的脂肪;提取液用乙腈以1∶4倍稀釋，降低濃度減少潛在干擾。

2.2 色譜條件的選擇

色譜柱選擇，三聚氰胺具有強極性和親水性特點，在普通反相色譜柱上幾乎無保留［18］。因此，本研究選用了ACQUITY UPLC BEH HILIC色譜柱，該色譜柱采用1.7μm未經鍵合的亞乙基橋雜化顆粒，適用于保留強極性、水溶性分析物，并且適合高有機相比例分析條件，同時能有效的提高分離能力、分析速度和靈敏度［19］。從圖1可以看出，采用乙腈-水體系作為流動相，在電噴霧離子源(ESI)正離子掃描模式和最佳質譜條件下，三聚氰胺的保留時間為0.51 min，定量、定性離子對分別為126.9/85.0、126.9/68.0。

圖1 三聚氰胺在乙腈-水體系下分離的TIC色譜圖(濃度為 2 μg/L)

流動相的選擇，對于UPLC-MS/MS來說，不僅要考慮對組分的洗脫能力，而且還需考慮在質譜中是否能促使目標化合物達到較高的離子化效率。本研究分別對乙腈-水體系、GB 22388－2008《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》中采用的乙腈-10 m mol/L乙酸銨(用乙酸調節至 pH值3.0)體系［20］、及 Desmarchelier等［21］報道的乙腈-10 m mol/L乙酸銨體系進行比較。從圖2可以看出，濃度為10 μg/L三聚氰胺標準溶液，在乙腈-水體系和乙腈-10 m mol/L乙酸銨體系下離子豐度和信噪比均無明顯差異，而在乙腈-10 m mol/L乙酸銨(用乙酸調節至pH值3.0)體系下離子豐度和信噪比均低40倍左右。因此選擇乙腈-水體系作為本方法的流動相。

2.3 質譜條件的選擇

配制一定濃度的標準溶液，采用流動注射泵連續直接進入質譜，利用IntelliStartTM技術，質譜自動對三聚氰胺進行特異性MRM數據采集方法的開發，確定了在ESI正離子模式下，三聚氰胺的準分子離子［M+H］+為126.9，定量、定性離子對分別為126.9/85.0、126.9/68.0，及其相應的錐孔電壓和碰撞能量。最后手動優化了毛細管電壓、離子源溫度、脫溶劑溫度、脫溶劑氣流速、錐孔氣流速等參數，確定最佳質譜條件。

圖2 三聚氰胺在不同流動相分離的TIC色譜圖(濃度為 10 μg/L)

2.4 標準曲線及方法檢測限

將上述配制成的質量濃度為0.5～100 μg/L系列的三聚氰胺標準工作液，在UPLC-MS/MS上進行測定，以定量離子峰面積為Y，各標準溶液質量濃度為X，得到線性回歸方程為Y=372.036X－57.505 1，相關系數為0.999 1;在空白樣品中逐級添加三聚氰胺標準溶液，加標濃度為5 μg/kg時，得到方法檢出限(LOD，S/N=3)為 0.005 mg/kg，方法定量限(LOQ，S/N=10)為0.017 mg/kg。

2.5 方法的精密度和回收率

將3個添加不同濃度水平的液態乳、乳粉、酸奶樣品按2.1方法進行樣品前處理和LC-MS/MS分析。在同一條件下每個濃度水平重復測定6次，計算添加回收率和相對標準偏差(RSD)，結果見表2。結果表明，添加回收率為91.3% ～97.1%，相對標準偏差(RSD)小于9.03%，說明本方法是準確可靠的。

表2 三聚氰胺加標回收率和精密度結果(n=6)

3 結論

建立了快速、經濟檢測乳及乳制品中三聚氰胺含量的UPLC-MS/MS分析方法。乳及乳制品樣品采用乙腈-水(體積比5∶5)為提取液，經超聲波提取、液液萃取除去蛋白質、脂肪等雜質后，適當稀釋直接進樣，在1.2 min內完成樣品分析。前處理省去了衍生化或固相萃取凈化的繁瑣操作過程，降低了試劑及耗材成本，分析階段采用UPLC-MS/MS節約了分析時間和增強了定性的準確性。該方法檢出限和定量限分別為0.005、0.017 mg/kg;不同濃度水平加標平均回收率為91.3% ～97.1%，相對標準偏差(RSD)小于9.03%。實驗結果表明，該檢測方法快速、經濟、準確、靈敏，適合我國乳及乳制品中三聚氰胺的定性、定量檢測要求。

［1］GB 5009.5－2010.食品安全國家標準食品中蛋白質的測定［S］.

［2］黃芳，黃曉蘭，吳惠勤，等.高效液相色譜-質譜法對飼料及食品添加劑中三聚氰胺的測定［J］.分析測試學報，2008，27(3):313－315.

［3］黃敏.食品和飼料中三聚氰胺檢測方法的研究進展［J］.食品科技，2011，36(11):301－305.

［4］周楊，馮群科，朱永林.高效液相色譜-串聯質譜法測定飼料中三聚氰胺［J］.中國飼料，2010，12:33－36.

［5］Yang H H，Zhou W H，Guo X C，et al.Molecularly imprinted polymer as SPE sorbent for selective extraction of melamine in dairy products［J］.Talanta，2009，80:821－825.

［6］趙寧，徐飛，吳小平，等.ELISA一步法快速檢測牛奶中三聚氰胺的研究［J］.中國畜牧獸醫，2011，38(4):124－126.

［7］劉世鵬，雷迎，黃國旺，等.三聚氰胺檢測方法的研究進展［J］.畜牧與飼料科學，2012，33(3):50－53.

［8］Sun H W，Wang L X，Ai L F，et al.A sensitive and validated method for determination of melamine residue in liquid milk by reversed phase high-performance liquid chromatography with solid-phase extraction［J］.Food Control，2010，21:686－691.

［9］梁劍，鐘茂生，朱品玲，等.水產品中三聚氰胺含量的快速檢測方法研究［J］.安徽農業科學，2009，37(28):13 446－13 447.

［10］Goscinny S.，Hanot V.，Halbardier J-F.，et al.Rapid analysis of melamine residue in milk，milk products，bakery goods and flour by ultra-performance liquid chroma-tography tandem mass spectrom etry From food crisis to accreditation［J］.Food Control，2011，22:226－230.

［11］趙善貞，鄧曉軍，伊雄海，等.固相萃取-親水相互作用色譜-串聯質譜法同時測定食品中三聚氰胺和三聚氰酸［J］.色譜，2012，33(7):677－683.

［12］盧躍鵬，方慧文，胡筱靜，等.親水作用色譜-串聯質譜法同時測定液態奶中三聚氰酸和三聚氰胺［J］.分析試驗室，2010，29(11):94－97.

［13］王飛，曹彥忠，李學民，等.固相萃取-超高壓液相色譜-電噴霧串聯質譜法測定蜂蜜中的三聚氰胺［J］.中國蜂業，2011，62:42－45.

［14］王靜，劉錚錚.使用超高效液相色譜-串聯質譜分析水樣中三聚氰胺［J］.環境化學，2011，30(10):1 828－1 829.

［15］Lutter P，Savoy-Perroud M C.，Campos-Gimenez E.，et al.Screening and confirmatory methods for the determination of melamine in cow’s milk and milk-based powdered infant formula Validation and proficiency-tests of ELISA，HPLC-UV，GC-MS and LC-MSMS［J］.Food Control，2011，22:903－913.

［16］徐競.面粉中三聚氰胺的高效液相色譜-質譜法測定［J］.現代面粉工業，2009，3:37－39.

［17］趙慧芬，水明，張雪林，等.液相色譜-質譜/質譜法測定乳品中三聚氰胺含量的簡便方法［J］.乳品加工，2009(1):43－45.

［18］胡梅，王駿，張卉，等.超高效液相色譜-質譜/質譜測定禽蛋制品中三聚氰胺［J］.山東農業科學，2010，(1):90－93.

［19］Michael J Yelle.Waters液相色譜柱及消耗品簡要指南2012/2013［M］.北京:沃特世公司中國印刷，2012:58－59.

［20］GB/T 22388－2008.原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法［S］.

［21］Desmarchelier A，Guillamon-Cuadra M，Delatour T，et al.Simultaneous quantitative determination of melamine and cyanuric acid in cow’s milk and milk-based infant formula by liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2009，57(16):7 186－7 193.