塊菌多糖提取工藝優(yōu)化及粗多糖抗氧化性的測定*

孔慶龍，樊建，趙天瑞

(昆明理工大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，云南昆明，650500)

塊菌(Truffle)又稱塊菇、松露、無娘藤、豬拱菌等，屬于子囊菌亞門塊菌目塊菌科塊菌屬，是地下真菌中的一個比較重要的子囊菌類群。子實體在土壤中生長，除個別種類在成熟時半露出土表外，大部分種類自始至終埋生于地下，是與樹木共生的外生菌根型藥食兩用真菌［1-2］。塊菌的主要活性成分有α-雄烷醇、神經(jīng)酰胺、塊菌多糖等［3-4］。研究表明:塊菌多糖作為一種新的真菌多糖，具有水溶性好、毒性低、抑制腫瘤作用明顯等特征，有望開發(fā)成抗腫瘤藥物;此外，塊菌多糖作為一種新的真菌多糖具有抗氧化、抗腫瘤、消炎等良好的生物活性，為保健品和藥品的開發(fā)提供了新的原料［4-6］。現(xiàn)有的多糖提取方法主要是酸提法、堿提法、超聲波輔助提取、酶輔助提取和水提法。酸提法會對多糖糖苷鍵造成破壞，堿提法會給后續(xù)的醇沉造成不良影響，超聲波和酶輔助法操作過程復(fù)雜。本文對熱水浸提法提取塊菌多糖，并對其進行了抗氧化試驗。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

印度塊菌(Tuber indicum):昆明食用菌所提供，產(chǎn)自云南，凍藏備用。

苯酚、濃 H2SO4、95%乙醇、葡萄糖、甲醇、DPPH、Na2HPO4、NaH2PO4、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、水楊酸、H2O2、FeSO4，均為分析純。

手提式高速粉碎機，溫嶺市大德中藥機械有限公司;分析天平(AL204型)，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;恒溫水浴鍋(HH-4)，金壇市杰瑞爾電器有限公司;循環(huán)多用真空泵(SHZ-D(Ⅲ)型)，鞏義市英峪予華儀器廠;TU1901型雙光束紫外可見光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠;飛鴿LXJ-ⅡB大容量離心機、TGL-16G冷凍離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

準(zhǔn)確稱取無水葡萄糖0.100 0 g于100 mL容量瓶中定容，制得1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，搖勻備用。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用硫酸-苯酚法［7］用移液管分別吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液2、4、6、8、10 mL，置于 50 mL 容量瓶中，加水至刻度，搖勻。再分別吸取上述溶液0.8 mL置于20 mL比色管中，以蒸餾水為空白對照，每個試管中加入新配制的5%的苯酚溶液0.8 mL，然后迅速加入濃硫酸5 mL，混合均勻后沸水浴30 min，冷卻至室溫。于490 nm波長處測定吸光度A，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程。

1.2.3 水提法塊菌多糖的工藝流程

原料烘干→粉碎→過70目篩→稱重→浸提→抽濾→濾液→真空濃縮至原體積1/4→過夜醇沉→離心→沉淀→真空干燥→粗多糖

1.2.4 樣品測定

準(zhǔn)確稱取過篩后的粉末0.5 g，按設(shè)定提取時間、溫度、液料比提取多糖，過濾取濾液定容至500 mL得到樣品溶液，精確吸取樣品溶液0.8mL，按1.2.2所述方法操作，將所測得的樣液的吸光值帶入回歸方程中，計算得出多糖產(chǎn)量從而得到塊菌多糖提取率。

1.2.5 單因素試驗

在其他條件都相同的情況下，分別考慮水浴時間(1、1.5、2、2.5、3、3.5、4 h)、水浴溫度(50、60、70、80、90、100℃)、液料比(10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1)3個因素對多糖提取率的影響。

1.2.6 響應(yīng)面試驗設(shè)計

由單因素試驗確定的塊菌多糖熱水浸提法提取工藝的因素水平，利用Design Expert 8.0軟件，采用中心組合試驗Box-Benhnken設(shè)計方案［8-9］。以自變量A、B、C分別表示提取時間、提取溫度、液料比3個單因素，以-1、0、1代表各因素的各水平值，按xi=(Xi-X0)/△X對自變量進行編碼，xi為變量的編碼值，Xi為變量的實際值，X0為中心點變量的真實值，△X為變量的變化步長，因素水平如表1所示。

表1 響應(yīng)面分析因素及水平

1.2.7 DPPH自由基清除能力測定

DPPH自由基清除能力測定參照Blois［10］的方法稍作修改。將塊菌粗多糖配成不同濃度的溶液，分別取1mL不同濃度的多糖溶液至離心管中，再分別加入2mL 0.05mmol/L的 DPPH溶液，混合均勻，于25℃恒溫避光反應(yīng)30min，在517nm處測定吸光值A(chǔ)x。同時以同體積甲醇和超純水分別取代DPPH溶液和多糖樣品作為調(diào)零，以同體積的超純水代替多糖溶液作為空白對照組A0，并為了消除多糖溶液自身吸光值影響，以同體積甲醇代替DPPH作為樣品對照組Ax0。清除率由下面公式得:

1.2.8 羥基自由基清除能力測定

羥基自由基清除能力測定參照Smirnff［11］的方法稍作修改。將塊菌粗多糖配成不同濃度的溶液備用。在離心管中依次加入1mL 9 mmol/L FeSO4、1mL不同濃度的多糖溶液、1mL 9 mmol/L H2O2搖勻靜置10 min，再加入1mL 9 mmol/L水楊酸乙醇溶液搖勻，于37℃保溫 30 min，冷卻至室溫，5 000 r/min離心10min，取上清液在510 nm處測吸光值A(chǔ)x。以等體積水代替多糖為空白對照組測吸光值A(chǔ)0，以等體積水代替水楊酸為樣品對照組測吸光值A(chǔ)X0，蒸餾水調(diào)零。清除率由下面公式得:

1.2.9 還原力測定

還原力測定參照Yen等［12］的方法修改。將塊菌粗多糖配成不同濃度的溶液備用。在離心管中依次加入1 mL 0.2 mol/L pH 6.6的磷酸緩沖液、1 mL不同濃度的多糖溶液、1 mL 1%鐵氰化鉀溶液于50℃水浴20 min，再加入1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%三氯乙酸，冰水冷卻，5 000 r/min離心10 min，取上清液1 mL再加入1 mL超純水和0.2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的三氯化鐵，反應(yīng)10 min后于700 nm處測吸光值。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素對塊菌多糖提取率的影響

影響塊菌多糖提取率的因素有很多，如提取時間、提取溫度、液料比等。在進行RSM分析前，應(yīng)先進行單因素試驗來確定試驗因素與水平。

2.1.1 提取時間的影響

確定液料比為60∶1(mL∶g)，提取溫度為90℃，提取時間分別為 1、1.5、2、2.5、3、3.5、4 h。分別測定多糖含量，以時間為橫坐標(biāo)、多糖提取率為縱坐標(biāo)繪制曲線，結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看出，在1～4 h內(nèi)多糖提取率隨著時間的延長而明顯提高，提取率在2 h前增加明顯，之后趨于平緩，3.5 h后幾乎持平。說明多糖的浸出過程與時間密切相關(guān)，時間過短，細(xì)胞溶脹性不好且多糖溶解不充分;時間過長，會使已經(jīng)溶出的多糖結(jié)構(gòu)的變化而使提取率降低。因此，為縮短工時減少能耗，所以選取3.5 h為響應(yīng)曲面設(shè)計中時間因素3個水平的中間值。

圖2 提取時間對多糖提取率的影響

2.1.2 提取溫度的影響

確定液料比為60∶1(mL∶g)，提取時間為2 h，提取溫度分別為 50、60、70、80、90、100℃。分別測定多糖含量，以提取溫度為橫坐標(biāo)、多糖提取率為縱坐標(biāo)繪制曲線，結(jié)果如圖3所示。從圖3知，在一定范圍內(nèi)提取溫度與多糖提取率成正相關(guān)。在50～90℃內(nèi)多糖提取率隨溫度的升高而顯著增加，可能原因是隨著溫度的升高，細(xì)胞溶脹度增大，傳質(zhì)強化，從而使得多糖的溶出率增加。而在90℃以后的多糖提取率略有降低，可能原因是溫度過高時粗多糖的糖苷鍵發(fā)生水解，多糖降解成單糖或寡糖，從而使粗多糖得率有所降低。考慮到高溫可能對多糖結(jié)構(gòu)和活性造成影響，且高溫更加耗能，因此選取90℃為響應(yīng)曲面設(shè)計溫度因素3個水平中的中間值。

圖3 提取溫度對多糖提取率的影響

2.1.3 液料比的影響

確定提取溫度為90℃，提取時間為3.5h，設(shè)定液料比(mL∶g)分別為 10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1。分別測定多糖含量，以液料比為橫坐標(biāo)、多糖提取率為縱坐標(biāo)繪制曲線，結(jié)果如圖4所示。從圖4可以看出，當(dāng)液料比為10∶1～30∶1時，多糖提取率隨液料比的增加十分明顯，在液料比為50∶1時提取率達(dá)到最高，而當(dāng)液料比繼續(xù)增加時多糖提取率變化并不明顯，因此估計當(dāng)液料比為50∶1時已經(jīng)將多糖充分溶出。液料比較小不利于原料中多糖的溶出，而液料比過高不僅會增大試劑的消耗量，而且不利于后期的分離濃縮。綜合考慮產(chǎn)品得率、試劑消耗及后續(xù)處理，選取50∶1(mL∶g)為響應(yīng)曲面優(yōu)化設(shè)計中液料比因素的中間水平。

圖4 液料比對多糖提取率的影響

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果分析

2.2.1 響應(yīng)面結(jié)果分析

利用Design Expert 8.0軟件，采用中心組合試驗Box-Benhnken設(shè)計方案方案，進行3因素3水平的響應(yīng)曲面工藝優(yōu)化試驗。試驗共設(shè)共15個試驗點，包括12個析因點和3個中心點。結(jié)果如表2所示。其中試驗號1～12是析因試驗，試驗號13～15是中心試驗。利用Design Expert 8.0統(tǒng)計軟件對表2試驗數(shù)據(jù)進行回歸分析，經(jīng)回歸擬合后，各因素與響應(yīng)值的回歸方程為:模型的方差分析見表3。

表2 響應(yīng)面分析方案及試驗結(jié)果

表3 變量方差分析表

由方差分析可知，模型的F值為59.54、P值為0.000 1，說明模型顯著，失擬項F值為7.16說明差異不顯著，未知因素對試驗結(jié)果影響小。該模型的復(fù)相關(guān)系數(shù)平方R2=0.990 8，修正相關(guān)系數(shù)平方=0.974 1，變異系數(shù)CV/%=0.64，這說明該試驗?zāi)Ｐ偷臄M合程度良好，能夠很好地描述試驗的結(jié)果，自變量和響應(yīng)值之間呈現(xiàn)顯著的線性關(guān)系，試驗誤差較小，模型方程可以很好地反映真實的試驗值，可用此模型來分析和預(yù)測水提塊菌多糖的工藝結(jié)果。同時能夠得知 A、B、C、AB、AC、A2、B2、C2等 8 項試驗因子對多糖提取率影響顯著，且各試驗因子對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系。根據(jù)方差分析和回歸方程，得到三維響應(yīng)面曲面圖，如圖5所示。

由RSM得到的三維圖形直觀的反應(yīng)了各個因素對響應(yīng)值的影響，其形狀也可以反應(yīng)出交互作用的強弱。由圖5可知在一定范圍內(nèi)塊菌多糖的提取率隨著提取時間和溫度的升高而升高，兩者交互作用顯著，同時可以看出提取溫度對提取率影響的顯著性大于提取時間;在一定范圍內(nèi)塊菌多糖的提取率隨著提取時間和液料比的升高而升高，兩者交互作用顯著，且提取時間對提取率影響的顯著性大于液料比;提取溫度與液料比的交互作用效果不顯著，且提取溫度的影響顯著性大于水料比。圖5顯示，3個因素對多糖提取率的影響以及各因素之間的交互影響與回歸分析結(jié)果吻合。

圖5 不同因素及其相互作用對塊菌多糖提取率影響的響應(yīng)曲面圖

2.2.2 響應(yīng)面的優(yōu)化

通過軟件優(yōu)化器對熱水浸提法提取工藝進行優(yōu)化，得到塊菌多糖提取的最佳工藝條件、理論最大提取率并進行驗證。驗證試驗綜合考慮實際情況和試驗條件，選擇工藝條件參數(shù)為提取時間3.7h，提取溫度95℃，液料比59∶1(mL∶g)，在此條件下進行3次平行試驗，實際測得塊菌多糖的提取率為10.73%、10.78%、10.75%，平均值為10.75%，與理論值的比較誤差為0.06%。由此可見，應(yīng)用RSM法得到的優(yōu)化工藝參數(shù)是準(zhǔn)確可靠的。

2.3 抗氧化能力

抗氧化能力使用EC50來進行評價。試驗中的EC50值指當(dāng)DPPH、羥基自由基清除率分別為50%時所需樣品的濃度，還原力試驗中700nm處吸光值為0.5時的樣品濃度。

2.3.1 DPPH自由基清除能力及羥基自由基清除能力

DPPH自由基清除能力的結(jié)果如圖6所示。研究結(jié)果表明塊菌多糖具有清除DPPH自由基的活性，其清除能力呈現(xiàn)出劑量依賴性，隨著提取物濃度的增加樣品對DPPH的清除率也隨之增加，當(dāng)濃度達(dá)到5 mg/mL時清除率達(dá)到95%，其 EC50值為1.12 mg/mL。

圖6 塊菌多糖DPPH和羥基自由清除能力

圖6 還顯示，塊菌多糖具有清除羥基自由基的活性，其清除能力呈現(xiàn)出劑量依賴性，隨著提取物濃度的增加樣品對羥基自由基的清除率也隨之增加，當(dāng)濃度達(dá)到5 mg/mL時清除率達(dá)到93%，其 EC50值為0.73 mg/mL。

2.3.2 還原力

塊菌多糖還原力測定結(jié)果如圖7所示。研究結(jié)果表明塊菌多糖具有一定的還原力，其還原能力呈現(xiàn)出劑量依賴性，隨著提取物濃度的增加還原力也隨之增加，其EC50值為2.46 mg/mL。

圖7 塊菌多糖的還原能力

3 結(jié)論

采用熱水浸提法提取塊菌多糖的工藝優(yōu)化條件為:時間3.71 h，溫度 94.68℃，液料比 58.66∶1(mL∶g)。綜合考慮實際情況和試驗條件，選擇工藝條件參數(shù)為提取時間3.7 h，提取溫度95℃，液料比59∶1(mL∶g)。在此條件下進行3次平行試驗，實際測得塊菌多糖的提取率平均值為10.75%，與預(yù)測值接近，證明試驗設(shè)計及分析方法可靠。

通過對塊菌抗氧化活性的研究，得知塊菌有較強的DPPH自由基和羥基自由基清除能力和較好的還原能力。表明塊菌多糖對人體的氧化損傷有一定的保護作用，為以后塊菌相關(guān)關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)提供了一定的參考和依據(jù)。

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