套式PCR法在肺炎支原體感染診斷中的應(yīng)用

馬少杰* 辛德莉

（1 民航總醫(yī)院兒科，北京 100123；2 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院兒科，北京 100050）

肺炎支原體是社區(qū)獲得性呼吸道感染的常見病原之一，MP感染導(dǎo)致的肺炎及肺外并發(fā)癥對兒童健康危害嚴重[1]。近些年來，臨床上應(yīng)用理論上對MP感染有效的藥物治療不順利的病例報道日益增多，進而分離到耐藥株[2]。本研究以套式PCR法為檢測方法，早期快速診斷MP感染、指導(dǎo)合理用藥。

1 對象與方法

1.1 臨床病例診斷和入選標(biāo)準(zhǔn)

①具有急性發(fā)熱、咳嗽等癥狀；②肺部聽診可聞中小水泡音和（或）X線檢查顯示肺部病灶；③血清檢測MP-IgM抗體、MP-PCR或者培養(yǎng)陽性[3]；④入選病例簽署知情同意書。

1.2 對象

2007年6月和2009年12月符合標(biāo)準(zhǔn)共計65例，男33例，女32例。年齡2～13歲，病程為（5±2.5）d。

1.3 MP-PCR檢測

1.3.1 標(biāo)本來源

入選病例分別采集咽拭子標(biāo)本。

1.3.2 MP培養(yǎng)基

PPLO基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加15%新生小牛血清、10%鮮酵母浸液、0.002%酚紅指示劑、1%葡萄糖及青霉素5萬U/100mL。

1.3.3 PCR方法

將MP培養(yǎng)液浸泡的咽拭子棉簽，反復(fù)擠壓棄掉棉簽，將浸泡液以16000r/min離心10min，棄去上清液后加標(biāo)本處理液100℃處理5min提取DNA[4]。分別應(yīng)用MP種特異的16SrRNA、23SrRNA基因套式PCR擴增。套式PCR試劑盒由無錫市克隆遺傳技術(shù)研究所提供。

1.3.4 結(jié)果觀察

取PCR擴增產(chǎn)物10μL與2μL溴酚蘭試劑點樣于2%瓊脂糖凝膠中，以100伏電壓電泳20～30min，出現(xiàn)目標(biāo)區(qū)帶：16SrRNA-nPCR為535bp左右為陽性，23SrRNA-nPCR為239bp左右為陽性。

1.4 肺炎支原體培養(yǎng)方法

將咽拭子標(biāo)本初步處理后接種于MP培養(yǎng)基中，混勻后置于37℃溫箱中孵育，如有MP生長，即發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸，使培養(yǎng)基pH下降，指示劑發(fā)生顏色變化，由紅變黃，可作為MP生長的指征。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對實驗結(jié)果進行分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差進行統(tǒng)計學(xué)描述，對計量資料進行正態(tài)性檢驗，明確正態(tài)分布后再進行下一步分析。各組間率的比較采用χ2檢驗，檢驗顯著性取α=0.05，P＜0.05有顯著性差異。

2 研究結(jié)果

MP檢測結(jié)果：65例咽拭子標(biāo)本提取DNA樣本行套式PCR檢測，16SrRNA-nPCR 陽性率為75.4%（49例），23SrRNA-nPCR陽性率為78.5%（51例），2種方法相比，P值等于0.687，無統(tǒng)計學(xué)差異。陽性臨床分離株和標(biāo)準(zhǔn)株（FH）套式PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后均出現(xiàn)MP目的條帶：535bp、239bp，證實為肺炎支原體。見表1～表2和圖1～圖2。

分離培養(yǎng)得到肺炎支原體31株，與套式PCR方法相比，培養(yǎng)法MP陽性率47.6%，23SrRNA-nPCR法陽性率78.5%（P＜0.001）。

3 討 論

MP是兒童和青少年社區(qū)獲得性感染的常見病原體，可引起多種呼吸道疾病及肺外并發(fā)癥。MP感染發(fā)病率呈增高趨勢，且發(fā)病年齡也有提前趨勢。目前尚無滿意的、單一的能早期、快速、經(jīng)濟而又簡易的MP感染檢測診斷方法。

表1 16SrRNA、23SrRNA基因套式PCR擴增法結(jié)果比較

表2 培養(yǎng)法和23SrRNA nPCR法檢測MP結(jié)果比較

圖1 部分臨床分離株23SrRNA套式PCR產(chǎn)物電泳圖

圖2 部分臨床分離株16SrRNA套式PCR產(chǎn)物電泳圖

MP檢測方法主要有分離培養(yǎng)法、電鏡法、血清學(xué)方法以及核酸探針法等。MP-IgM抗體檢測應(yīng)用的是酶聯(lián)免疫法，但由于MP-IgM多在發(fā)病1周左右出現(xiàn)，因而單份血清標(biāo)本多在病程滿7d后檢查陽性率高，不利于早期診斷。本研究中65份血清標(biāo)本均采集于病程滿7d后，MP-IgM結(jié)果均為陽性。分離培養(yǎng)法是診斷MP感染的金標(biāo)準(zhǔn)，是常用的診斷方法之一。MP培養(yǎng)法需要采集臨床咽拭子標(biāo)本，將標(biāo)本接種于MP培養(yǎng)基中孵育，觀察培養(yǎng)基顏色變化：如有MP生長，指示劑發(fā)生顏色變化。MP培養(yǎng)難度較大，且MP生長緩慢，一般于孵育7-15天后培養(yǎng)基出現(xiàn)顏色變化，因而限制應(yīng)用于早期臨床診斷。

MP-PCR檢測法相對來說更加敏感、安全和可靠，可以與血清學(xué)和（或）培養(yǎng)法聯(lián)合進行診斷。nPCR方法是國內(nèi)外眾多學(xué)者在PCR技術(shù)廣泛應(yīng)用的基礎(chǔ)上，發(fā)展并形成用來研究支原體的技術(shù)。nPCR是通過“外”、“內(nèi)”兩對引物，即一對擴增較大DNA片段的“外” 引物和一對在擴增產(chǎn)物中再擴增小片段的“內(nèi)”引物的一種PCR技術(shù)。目前，nPCR技術(shù)已在組織細胞培養(yǎng)中的支原體污染、動物支原體病診斷和人類疾病與支原體感染中得到了廣泛的應(yīng)用[5,6]。

本研究采用nPCR法檢測MP感染，雖然兩種方法無差異，但與培養(yǎng)法相比，其特異性和準(zhǔn)確性提高，利于早期診斷。由于分離MP難度較大，在一定程度上限制了臨床觀察的開展，本研究樣本例數(shù)偏少，需要進一步擴大樣本量來評價效果。

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