黃芪扶正湯聯(lián)合順鉑對LewiS肺癌荷瘤小鼠的治療作用

黃玉娥 李愛玲 羅偉強 高妙萍 陳國剛

（1 廣州醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院藥劑科，廣東 廣州510150；2 廣州市荔灣區(qū)第三人民醫(yī)院藥劑科，廣東 廣州510380；3 廣州市胸科醫(yī)院藥劑科，廣東 廣州510095）

人類進入工業(yè)化時代以來，惡性腫瘤尤其是肺癌，一直都威脅 著人類的健康。它5年生存率約為15%，其發(fā)病率及病死率仍在不斷上升[1]。目前臨床上對于肺癌的治療并無理想的治療手段，大多數(shù)采用化療或放療，在治療的同時對人體將會產(chǎn)生巨大的副作用，如抑制人體白細胞數(shù)目，降低人體抗感染的能力等。有研究表明，經(jīng)過三維放療治療的患者中仍然有30%左右出現(xiàn)不同程度的肺損傷[2]。化療療效肯定，但它毒副作用廣泛且嚴重，對腫瘤患者的恢復極其不利，也損害了機體的免疫系統(tǒng)，導致腫瘤可能復發(fā)。近年來的生物靶向治療藥物雖然特異性強，不良反應(yīng)低。但它價格昂貴。近年來中醫(yī)在防治腫瘤方面的優(yōu)勢逐漸明顯，中醫(yī)西醫(yī)相輔相成，充分發(fā)揮我國獨有的防癌治癌特色和優(yōu)勢，延長生存期的目的[3,4]。

黃芪扶正湯這一經(jīng)驗方由黃芪、黃精、構(gòu)祀、女貞子和靈芝組成，該五味中藥均能不同程度的提高機體的免疫能力，但是未見該經(jīng)驗方用于抗肺腫瘤方面的報道。為了驗證該方的抗腫瘤作用，我們以Lewis肺癌荷瘤小鼠為模型，觀察其對腫瘤的發(fā)生以及轉(zhuǎn)移的抑制作用，并比較該方對化療藥的減毒作用，為開發(fā)本方藥新用途提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及細胞

近交es7BL/6純系6～8周齡雄性小鼠（sPF級）46只，體質(zhì)量介于16～20g，購于中山大學實驗動物部，合格證號：粵實動證字2010034號。小鼠Lewis肺癌細胞株，購于中山大學醫(yī)學院細胞中心實驗室。

1.2 實驗藥物和試劑

采用黃芪、黃精、構(gòu)祀、女貞子和靈芝按比例2∶1∶1∶1∶1制備黃芪扶正湯。組分各種藥物均為同一批次統(tǒng)一購于本院中藥房。采用水浸泡法，煮沸法等，得到粉劑放入4℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｓ蒙睇}水將順鉑（齊魯制藥有限公司）配置為0.2mg/mL的溶液待用。DMEM培養(yǎng)基和RPMI- 1640購自北京索萊寶科技有限公司；小牛血清和胰蛋白酶購自杭州四季青生物技術(shù)公司；DMSO（二甲基亞礬）和Con-A購自美國AMRESCO公司。

1.3 細胞培養(yǎng)

根據(jù)文獻[4], 將細胞置于含5%CO2，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基為DMEM（10%小牛血清，100μ/mL青霉素，100μ/mL鏈霉素），待細胞進入對數(shù)生長后，經(jīng)0.25%胰蛋白酶溶液消化傳代，臺盼藍拒染法測定活細胞數(shù)，用無血清培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細胞濃度為1×107個/mL，制成細胞懸液備用。

1.4 實驗分組及給藥

根據(jù)文獻[4]，將接種后的小鼠隨機分為五組，分別為空白組、模型組、順鉑組、黃茂扶正湯組、化療+中藥組。待小鼠成瘤后，腹腔注射順鉑2mg/kg治療[5]，共給藥5次；中藥組每日灌服黃茂扶正湯溶液10mL/（kg?d），共14d；化療+中藥組兩藥用法同前；對照組給予等量的生理鹽水灌胃。每天密切觀察小鼠體質(zhì)量變化，并記錄腫瘤最長徑（a）和最短徑（b）。

1.5 標本采集

根據(jù)文獻[4]，給藥后第7天，腹腔給藥麻醉小鼠，由尾靜脈取血50μL，并分離眼球血血清。腫瘤標本：用眼科剪摘除腫瘤迅速稱重記錄后使用10%的中性甲醛溶液保存。肺標本：Boulns液固定小鼠肺24h，經(jīng)無水乙醇漂洗。計數(shù)各肺葉表面的Lewis肺癌轉(zhuǎn)移灶數(shù)，計算肺轉(zhuǎn)移抑制率。骨髓有核細胞標本：來源于小鼠完整右側(cè)股骨，用白細胞計數(shù)板載顯微鏡下計數(shù)洗液中骨髓有核細胞數(shù)

1.6 測定外周血白細胞數(shù)和骨髓有核細胞數(shù)

根據(jù)文獻[5]，用白細胞計數(shù)板在顯微鏡下計數(shù)洗液中骨髓有核細胞數(shù)或外周血白細胞數(shù)，按下列公式計數(shù)/L=4個大方格內(nèi)白細胞總數(shù)×10/4×20×106。

1.7 統(tǒng)計學分析

采用SPSSl3.0軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學處理，計量資料用均數(shù)±標準差（mean±S）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用S-N-Kq檢驗法，計數(shù)資料的比較采用t檢驗。以P＜0.05認為有顯著性差異。

2 實驗結(jié)果

2.1 黃芪扶正湯可以抑制腫瘤的生長

各組小鼠在腫瘤細胞接種后第7天開始，右上肢背部可摸到直徑約3～6mm。與空白對照組小鼠比較，其中模型對照組和化療組小鼠出現(xiàn)活動及進食減少，精神萎靡不振等現(xiàn)象最為明顯，中藥組表現(xiàn)較輕。各組小鼠腫瘤逐日增大，增長速度最快的為模型對照組，最慢的為化療+中藥組（圖1，表1）。并且，中藥組瘤重較模型對照組減輕（P＜0.05）；化療組、中藥組、化療+中藥組的抑瘤率分別是52.0%，387%，68.96%（表2，圖2）。

圖1 各組小鼠的腫瘤生長曲線

表1 各實驗組小鼠體質(zhì)量增長的變化（均數(shù)±標準差）

表2 治療后各組Lewis肺癌小鼠瘤重和抑瘤率的比較（均數(shù)±標準差）

2.2 黃芪扶正湯抑制腫瘤肺轉(zhuǎn)移灶的形成

從表3可以看出，相對于模型對照組而言，中藥組可減少肺轉(zhuǎn)移灶的形成，中藥加化療組肺轉(zhuǎn)移數(shù)最少。

2.3 黃芪扶正湯促進小鼠白細胞和骨髓有核細胞增生

圖2 治療后各組Lewis肺癌小鼠瘤重的比較

表3 治療后各組Lewis肺癌小鼠瘤重和抑瘤率的比較（均數(shù)±標準差）

表4 各實驗組對小鼠白細胞數(shù)和骨髓有核細胞數(shù)的影響（均數(shù)±標準差）

如表4所示，相對于模型對照組而言，接受順鉑治療組外周血白細胞和骨髓有核細胞數(shù)下降（P＜0.05），而同時接受化療和中藥治療組白細胞數(shù)和有核細胞數(shù)均有升高（P＜0.05）。

3 討 論

腫瘤是機體自身細胞在各種內(nèi)外致癌因素作用下發(fā)生轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的。腫瘤細胞在生物學特征及免疫學方面與機體正常細胞不同，必然導致機體的免疫應(yīng)答，主要是細胞免疫。肺癌患者體內(nèi)常呈現(xiàn)免疫功能抑制狀態(tài)[6]，因此肺癌免疫治療獲得了極大的關(guān)注。我國近年來在中草藥治療肺癌方面，取得了較大的突破。動物實驗和臨床試驗表明[7]，黃芪扶正湯能夠提高小鼠的免疫功能和改善老年人的細胞及體液免疫功能。目前化療仍然是治療腫瘤的主要手段，但是化療藥物往往會對正常組織或細胞均有不同程度的抑制作用。化療藥物的毒副作用限制了該類藥物在臨床上療效的進一步提高。因此臨床上迫切需要利用藥物聯(lián)合應(yīng)用來提高藥物的療效和降低化療藥物的毒副作用。

研究表明黃芪和黃精均可以通過增加骨髓造血干細胞數(shù)目和外周白細胞數(shù)目來增加機體的免疫能力[7-9]，構(gòu)祀也能明顯促進小鼠造血功能[10,11]。本中藥復方成分為黃芪、黃精、構(gòu)祀、女貞子、靈芝五味中藥，雖然每味中藥均能改善機體的免疫功能，但是復方是否也能從提高自身免疫能力的角度來抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及減弱化療藥物的毒副作用呢？本實驗結(jié)果顯示中藥組的瘤重減輕（P＜0.05），瘤體積減小、肺轉(zhuǎn)移數(shù)減少 （P＜0.05）。同時中藥組腫瘤生長速度減慢。說明應(yīng)用黃芪扶正湯對腫瘤生長和肺部轉(zhuǎn)移有一定的抑制作用。并且我們采用了順鉑作為實驗的陽性對照。在實驗中觀察各組小鼠用藥后的基本情況。結(jié)果提示，化療組小鼠出現(xiàn)精神萎靡，活動遲緩等現(xiàn)象，中藥組以及中藥組+化療組小鼠情況較好，無明顯消瘦或聚集現(xiàn)象。可能原因是由于化療藥物的不良反應(yīng)導致小鼠進食減少，體質(zhì)量增加減少，而聯(lián)合中藥治療后，明顯提高化療效果。說明黃芪扶正湯對化療藥物具有解毒作用，聯(lián)合用藥可以增加化療藥物的療效。結(jié)果同時提示，應(yīng)用順鉑治療后，小鼠的白細胞和骨髓有核細胞被抑制，表現(xiàn)為細胞數(shù)目下降，但是聯(lián)用黃芪扶正湯后，外周血白細胞數(shù)和骨髓有核細胞數(shù)均高于順鉑單獨使用組，提示該中藥復方可以減輕化療藥物的毒副作用。但是黃芪扶正湯具體抑制腫瘤的機制仍然需要進一步治療。

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