CO2及溫度對顯微活細胞培養系統動態觀察活細胞Ca2+變化的影響

吳偉全，李元歌，王思捷，王永存，吳 平

(1、廣東醫學院臨床醫學研究中心，廣東 湛江 524001；2、廣東醫學院附屬醫院放射科，廣東 湛江 524001；3、廣東醫學院附屬醫院腫瘤科，廣東 湛江524001)

隨著生物醫學研究的發展，通過激光掃描共聚焦顯微鏡動態觀察活細胞內離子變化，特別是鈣離子，是目前研究的熱點[1]。而動態觀察活細胞內離子變化實驗研究中，通過維持最佳CO2及溫度條件去維持細胞活性狀態尤為關鍵。但是目前活細胞內離子變化動態觀察中，CO2及溫度條件改變對活細胞活性狀態產生影響尚不完全清楚。本實驗通過顯微活細胞培養系統改變CO2及溫度條件，探討CO2及溫度對動態觀察活細胞Ca2+變化的影響，為活細胞動態觀察實驗研究中維持最佳CO2及溫度條件提供理論和實驗依據。

1 材料和方法

1.1 材料、主要儀器及試劑 活細胞A549為本實驗室保存。激光掃描共聚焦顯微鏡(德國Leica公司)；顯微活細胞培養系統(德國IncubatorS-2、CTIController 3700 digital、Tempcontrol 37-2 digital)；35 mm NEST激光共聚焦培養皿 (耐思生物科技有限公司)；DMEM高糖培養基(Gibco公司)；新生小牛血清(民海生物公司)；青霉素-鏈霉素雙抗試劑(杭州吉諾公司)；0.25%胰酶 (Trypsin)-0.02%EDTA溶液 (杭州吉諾公司)；PBS緩沖液(武漢博士德公司)；Fluo-4/AM 熒光染色劑(美國Invitrogen公司)。

1.2 活細胞A549的激光共聚焦培養皿培養 人肺上皮細胞株A549細胞接種于35 mm NEST激光共聚焦培養皿，培養于DMEM高糖培養液中,其中含小牛血清10%、青霉素(100 mg/L)和鏈霉素(100 mg/L),置于37℃、5%CO2培養箱中無菌培養。第二天細胞長滿70%～80%皿底可用于活細胞動態觀察。

1.3 顯微活細胞培養系統的建立 將顯微培養器IncubatorS-2安置于激光掃描共聚焦顯微鏡的鏡頭上，IncubatorS-2與溫度控制裝置Tempcontrol 37-2 digital及CO2控制裝置CTI-Controller 3700 digital管道聯通，CTI-Controller 3700 digital再與CO2鋼瓶管道聯通，建立顯微活細胞培養系統[2]。

1.4 CO2及溫度的控制和實驗分組 CO2及溫度可以通過CTI-Controller 3700 digital和Tempcontrol 37-2 digital正常工作進行控制。細胞分為A組：5%CO2維持37℃溫度正常實驗組、B組：無CO2但維持37℃溫度組和C組：5%CO2室溫溫度組三個組，每組重復3次。

1.5 活細胞Ca2+變化的動態觀察 將各組細胞培養于35 mm激光共聚焦培養皿中間的圓形凹槽里。染色前吸除培養皿的培養液，用PBS洗2～3次；向培養皿中輕輕滴入Fluo-4/AM工作液200μl，使其覆蓋凹槽里全部細胞；37℃、5%CO2培養箱中孵育30 min；吸除染液，用PBS洗2～3次；再用800μl的DMEM高糖培養液覆蓋凹槽里全部細胞，將激光共聚焦培養皿放在顯微培養器IncubatorS-2里，加H2O2后，用激光掃描共聚焦顯微鏡動態觀察Ca2+的變化。

1.6 統計學方法 實驗數據采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析。計量數據用±s表示，采用方差分析(One-Way-ANOVA)，多樣本均數比較選用LSD法、Dunnett法。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 顯微活細胞培養系統能有效控制活細胞的CO2及溫度 顯微培養器IncubatorS-2、溫度控制裝置 Tempcontrol 37-2 digital和 CO2控制裝置CTI-Controller 3700 digital三者結合激光掃描共聚焦顯微鏡，建立的顯微活細胞培養系統能有效控制CO2及溫度，正常情況下可以維持活細胞的5%CO2及37℃溫度，以維持活細胞較好的狀態(見圖1、圖 2)。

圖1 CO2控制裝置CTI-Controller 3700 digital

圖2 溫度控制裝置Tempcontrol 37-2 digital

2.2 CO2及溫度對活細胞A549內Ca2+變化的影響細胞內Ca2+變化結果見圖3、圖4、圖5和表1。A549細胞內可見鈣離子表達，表現為綠色熒光，其強弱反映細胞內鈣離子濃度高低。A組A549細胞呈長梭形，狀態較好，加H2O2后熒光強度從2 min到5 min內隨著時間的延長逐步增強(P<0.05)；B組A549細胞大部分呈長梭形，狀態一般，加H2O2后熒光強度從1 min到5 min內隨著時間的延長逐步減弱 (P<0.05);C組A549細胞大部分呈長梭形，狀態一般，加H2O2后熒光強度從2 min到5 min內隨著時間的延長逐步減弱 (P<0.05)。與A組的 比較，B 組 1 min、 2 min、3 min、4 min 和 5 min時間點熒光強度分別減弱(P<0.05)；與A組的比較，C 組 2 min、3 min、4 min 和 5 min 時間點熒光強度分別減弱(P<0.05)。

3 討論

圖3 A組A549細胞內Ca2+變化的動態觀察

圖4 B組A549細胞內Ca2+變化的動態觀察

圖5 C組A549細胞內Ca2+變化的動態觀察

表1 三組A549細胞不同時間點熒光強度比較

激光掃描共聚焦顯微鏡是80年代發展起來的一項劃時代意義的高科技新產品，它是在熒光顯微鏡成像基礎上加裝了激光掃描裝置，激發熒光探針，從而得到細胞的熒光圖象，在亞細胞水平上觀察諸如Ca2+、膜電位等生理信號及細胞形態的變化，成為生物醫學研究領域中強有力的研究工具[3]。本院臨床醫學研究中心配置是德國Leica TCSII激光掃描共聚焦顯微鏡，具有活細胞動態觀察成像、多重熒光分離及重組成像和三維重構成像等功能。另外通過顯微培養器IncubatorS-2、溫度控制裝置Tempcontrol 37-2 digital和 CO2控制裝置CTI-Controller 3700 digital三者結合激光掃描共聚焦顯微鏡，建立的顯微活細胞培養系統，實驗結果表明其能有效控制CO2及溫度。

細胞內鈣作為第二信使對細胞生長分化起著重要作用，而目前用于監測細胞內游離鈣的方法少之又少，激光掃描共聚焦顯微鏡的誕生為人們提供了一種有效工具[4]。研究表明10μM H2O2對細胞內游離鈣的刺激在短時間內是上升的[5]。本實驗對照組A組在5%CO2維持37℃溫度時，活細胞動態觀察結果顯示10μM H2O2對A549細胞內游離鈣的刺激在短時間內也是上升的，與相關研究一致。

CO2是細胞培養生存必需條件之一。細胞培養時一般把細胞置于95%空氣加5%二氧化碳混合氣體環境中。CO2既是細胞代謝產物，也是細胞生長繁殖所需成分它在細胞培養中的主要作用在于維持培養基的pH值[6]。溫度對細胞培養的有重要意義。維持培養細胞旺盛生長，必須有恒定適宜的溫度(維持37℃)。溫度上升不超過39℃時，細胞代謝與溫度成正比；41℃1 h，細胞器結構發生改變，細胞線粒體損傷，大部分細胞調亡；當溫度在43℃以上1h，細胞全部死亡[7]。而低溫對細胞也有一定影響，細胞處在4℃～36℃之間，細胞的代謝速度會減慢[8]。因此，本實驗作為對照組A組是采用CO2及溫度是5%CO2維持37℃，結果顯示活細胞A549呈長梭形，狀態較好。

本實驗中通過溫度控制裝置Tempcontrol 37-2 digital及CO2控制裝置CTI-Controller 3700 digital改變溫度及CO2，探討CO2及溫度對動態觀察活細胞Ca2+變化的影響。實驗結果顯示B組在無CO2但維持37℃溫度時，活細胞A549大部分呈長梭形，狀態一般，加藥物后熒光強度從1 min到5 min內隨著時間的延長逐步減弱；與對照組比較，其 1 min、 2 min、3 min、4 min和 5 min時間點熒光強度分別減弱。實驗結果顯示C組在5%CO2室溫溫度時，活細胞A549大部分呈長梭形，狀態一般，加藥物后熒光強度從2 min到5 min內隨著時間的延長逐步減弱。與對照組比較，其2 min、3 min、4 min和5 min時間點熒光強度分別減弱。實驗結果表明CO2及溫度改變對動態觀察活細胞Ca2+有較大的影響，實驗結果B組及C組的活細胞由于CO2或溫度的改變，活細胞狀態一般，動態觀察中可能發生熒光淬滅，因此熒光逐步減弱。而A組活細胞A549呈長梭形，狀態較好，因此維持5%CO2及37℃為活細胞動態觀察實驗中CO2及溫度的最佳條件。

[1]Zhou YJ,Song YL,Zhou H,et al.Influx of extracellular calcium participates in rituximab-enhanced ionizing radiation-induced apoptosis in Raji cells[J].Toxicol Lett,2012,209(3):221-6.

[2]Kawaguchi A,Ogawa M,Saito K,et al.Differential expression of Pax6 and Ngn2 between pair-generated cortical neurons [J].J Neurosci Res,2004,78(6):784-95.

[3]Hanrahan O,Harris J,Egan C.Advanced microscopy:laser scanning confocal microscopy[J].Methods Mol Biol.2011,784:169-80.

[4]Ma HL,Xu SS,He RH,et al.Study on Ca2+transmembrane behaviors of magnetic-treated S.aureus with Fura-2/AM fluorescence probe and LCSM[J].Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi,2012,32(2):407-10.

[5]黃文峰,廖貴華.H2O2對原代培養的豬肺動脈內皮細胞鈣離子的影響[J].社區醫學雜志,2010,8(19):1-3.

[6]Anderson KM,Jajeh J,Guinan P,et al.In vitro effects of dichloroacetate and CO2on hypoxic HeLa cells.Anticancer Res,2009,29(11):4579-88.

[7]杜 娟,狄和雙,王根林.奶牛乳腺上皮細胞系的建立及高溫對細胞超微結構的影響[J].生物工程學報,2007,23(3):471-476.

[8]池 貝，劉 娜，董大鵬,等.非凍存低溫下維持貼壁培養細胞[J].實驗與檢驗醫學,2011,29(1):35-36.