三種布魯氏菌病疫苗株的毒力比較

程君生，吳梅花，趙麗霞，彭小兵，丁家波，王 楠，夏業(yè)才，毛開榮

(1.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081;2.金宇保靈生物藥品有限公司，呼和浩特 010030)

布魯氏菌病(簡稱布病)是一種世界范圍流行的人畜共患病，嚴重威脅人類和多種動物的生命健康，造成巨大的經(jīng)濟損失。布病導(dǎo)致動物流產(chǎn)、不孕和奶產(chǎn)量減少等，同時也引起嚴重的公共衛(wèi)生安全問題［1-2］。絕大多數(shù)布魯氏菌菌株都可以感染人，并引起嚴重的疾病，需要長時間的抗生素治療，而且往往會留下嚴重的后遺癥［3］。截至2007年的十五年中，布病疫情呈持續(xù)增長態(tài)勢，愈演愈烈［4］。根據(jù)衛(wèi)生部網(wǎng)站上的疫情公告，從2009年至2011年，我國人間布病新發(fā)病人數(shù)均超過3萬人，處于歷史最高水平。

疫苗免疫是防控家畜布病的主要措施。我國現(xiàn)有獸用布病疫苗制苗菌株有3種，分別為羊種布魯氏菌M5或M5-90弱毒株、豬種布魯氏菌S2弱毒株和牛種布魯氏菌A19弱毒株［4］。20世紀70-90年代，以上3種疫苗對我國布病疫情的控制起了至關(guān)重要的作用。至今，這3種疫苗仍在我國被廣泛使用。布魯氏菌病屬不同種型的菌株在外界各種因素的影響下可以發(fā)生變異，特別是在實驗室里，由于長期菌株保存的不當而發(fā)生變異的現(xiàn)象更為常見［5］。作為一種重要的人畜共患細菌病活疫苗，菌株的遺傳穩(wěn)定性是確保疫苗質(zhì)量的前提。毒力測定是監(jiān)測菌株是否變異的方法之一，也是確保疫苗安全的重要保證。國際上通常有3種方法反映布魯氏菌的毒力:對豚鼠的最小感染量、感染豚鼠的脾臟含菌量以及感染小鼠體內(nèi)的存活時間，其中對豚鼠的最小感染量通常用于對強毒株布魯氏菌毒力的測定。為了系統(tǒng)比較以上3種疫苗株的毒力，本研究用小鼠體內(nèi)存活時間和豚鼠脾含菌量2種方法，對上述3種布病疫苗株的毒力進行了測定和分析。

1 材料與方法

1.1 菌株及試劑 牛種布病疫苗(A19株)、豬種布病疫苗(S2株)均來自國家獸醫(yī)微生物菌種保藏中心;羊種布病疫苗(M5株)來自國內(nèi)某獸用生物制品生產(chǎn)企業(yè)。胰眎瓊脂培養(yǎng)基、蛋白胨水、PBS、生理鹽水等由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所基礎(chǔ)保障處參照《中國獸用生物制品規(guī)程》二○○○年版制備。PCR反應(yīng)試劑盒(Lot:DR001B)、DNA Marker DL2000(Lot:D501A)均購自TAKARA公司。

1.2 實驗動物 雌性 Balb/c小鼠(SPF級)和Hartley豚鼠(SPF級)均購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

1.3 菌液制備與濃度測定 分別將各凍干布病疫苗菌株用生理鹽水溶解后，劃線接種于胰眎瓊脂培養(yǎng)基，置37℃培養(yǎng)48 h，用生理鹽水沖洗培養(yǎng)物制成懸液，立即置于冰水中。充分混勻后，取0.1 mL菌液在96孔酶標板上用生理鹽水作2倍梯度稀釋至第11孔，用分光光度計測定OD600值。將原始菌液稀釋至OD600=0.1后，再用生理鹽水作連續(xù)10倍梯度稀釋至10-6，取該稀釋管接種胰眎瓊脂平皿，每皿接種0.1 mL，每個樣品接種3塊平皿。將計數(shù)的平皿置于37℃溫箱培養(yǎng)72 h，根據(jù)菌落計數(shù)結(jié)果計算菌液濃度。

1.4 疫苗株在小鼠體內(nèi)的存留時間測定 將16～18 g的健康雌性BALB/c小鼠120只，隨機分為3組，分別腹股溝皮下接種疫苗株A19、M5、S2，每組40只，注射劑量均為1×105CFU/只。接種后每隔2周撲殺5只小鼠，取出脾臟，加入1 mL無菌生理鹽水后，用小型組織勻漿機(IKA)將其搗碎。分別取勻漿按原液0.1 mL涂布胰眎瓊脂平板，置于37℃溫箱培養(yǎng)72 h，觀察細菌生長情況。參照已發(fā)表的文獻［6-7］，設(shè)計表1所示的各引物，用于對分離菌進行特異性鑒定。

表1 用于區(qū)分布魯氏菌種屬的PCR引物序列

1.5 疫苗株對豚鼠的毒力 參照《中華人民共和國獸醫(yī)生物制品規(guī)程》二〇〇〇年版對布病疫苗菌種毒力的測定方法［8］，取350～400 g的健康雌性豚鼠15只，隨機分為3組，每組5只，分別腹股溝皮下接種疫苗株 A19、M5、S2，注射劑量均為1×109CFU/只。接種后15 d撲殺各組豚鼠，無菌采集脾臟混合稱重。根據(jù)稱重結(jié)果，分別加入等量滅菌生理鹽水，用小型組織搗碎機將各組樣品搗碎，制成懸液。吸取0.1 mL，用生理鹽水10倍梯度連續(xù)稀釋，分別取1∶10和1∶100稀釋液涂布胰眎瓊脂平板，置于37℃溫箱培養(yǎng)72 h，選擇合適的稀釋度計算每克脾臟細菌含量。

2 結(jié)果

2.1 菌液制備與濃度測定 各疫苗株在胰眎瓊脂培養(yǎng)基上均能良好生長。按1.3中描述的方法，計算OD600=0.1時三種布魯氏菌的濃度。結(jié)果在此濁度下，A19、M5 和 S2的濃度均約為2.5 ×109CFU/mL。

2.2 各疫苗株在小鼠體內(nèi)的存留時間 疫苗免疫后實驗小鼠脾臟內(nèi)分離細菌生長情況見表2。

表2 各布魯氏菌疫苗株在小鼠體內(nèi)不同時間分離細菌情況

從平板上隨機挑取3個菌落，用AMOS-PCR方法對分離菌進行特異性鑒定。PCR電泳結(jié)果顯示，從小鼠脾臟中分離的各細菌均與免疫株一致，即牛種布魯氏菌S19株出現(xiàn)大小為178 bp和494 bp的特異性條帶，羊種布魯氏菌M5株出現(xiàn)大小為178 bp和733 bp的特異性條帶，豬種布魯氏菌S2株出現(xiàn)大小為178 bp和285 bp的特異性條帶(圖1)。

2.3 各疫苗株對豚鼠的毒力 疫苗免疫后15 d，取豚鼠脾臟計數(shù)克脾臟含菌量，結(jié)果見表3。A19疫苗株感染的豚鼠克脾臟含菌量最高為17萬，S2最高為1.5萬，均不超過20萬，符合我國《獸用生物制品規(guī)程》中對布病疫苗種毒的毒力規(guī)定［7］。M5疫苗株感染的豚鼠克脾臟含菌量最低為67萬，高于規(guī)定標準。

圖1 小鼠脾臟分離菌的PCR種屬鑒定結(jié)果

表3 不同疫苗株免疫的豚鼠脾臟含菌量測定結(jié)果

3 討論

布魯氏菌是一種細胞內(nèi)寄生菌，其感染動物后，會激發(fā)機體的體液免疫和細胞免疫反應(yīng)，其中細胞免疫對抗感染起著主要作用。由于活疫苗可以激起有效的細胞免疫，產(chǎn)生良好的保護效果，因此迄今為止，絕大多數(shù)成功應(yīng)用的疫苗都是弱毒疫苗。我國目前使用的A19、M5和S2疫苗株，均為光滑型弱毒疫苗。不同布病疫苗株其毒力也各不相同，其毒力的大小決定了該疫苗的安全性。

豚鼠對布魯氏菌具有高度的敏感性，是研究布病的良好試驗?zāi)Ｐ停Ｓ糜诜蛛x布魯氏菌，測定布魯氏菌毒力，檢定布病疫苗的效力等［9］。《獸用生物制品規(guī)程》中對布病疫苗種毒的毒力規(guī)定，以10億劑量的活菌免疫豚鼠14～15 d后，每組(5只/組)豚鼠的克脾臟含菌量應(yīng)不超過20萬個［8］。本研究結(jié)果顯示，M5毒力最強，A19次之，S2最弱。

小鼠體內(nèi)持續(xù)期也是常用作評價布病疫苗株安全性的重要指標之一，其對布魯氏菌的敏感性僅次于豚鼠。一般來說，強毒布氏菌具有在體內(nèi)持續(xù)感染的特征，體內(nèi)持續(xù)感染的時間越長，對機體的損傷會越大。對于弱毒菌株，體內(nèi)感染時間的增加，有提高免疫保護力的有利作用，但也增加了毒力變強的可能性。本研究中A19和S2疫苗株在小鼠體內(nèi)的持續(xù)時間分別為14周和6周，而M5卻超過了16周，同樣證明了M5疫苗的毒力超過了其他2個疫苗株。

相對于其他種的光滑型布魯氏菌疫苗株，羊種布魯氏菌疫苗株的穩(wěn)定性相對較差。有報道稱，國際上較早使用的羊種布病疫苗株Rev.1在適當?shù)臈l件下毒力可以完全恢復(fù)［10-11］。因此，對這類疫苗菌株的繁殖制備需要嚴格控制。我們的試驗研究顯示，M5疫苗在小鼠體內(nèi)存活時間較長，在豚鼠體內(nèi)含菌量較高，是否與疫苗菌株在制備繁殖中控制不當或在一定條件下有毒力返強有關(guān)，需進一步證實。

為保證疫苗使用的安全性和有效性，有必要對布魯氏菌病疫苗菌株的遺傳穩(wěn)定性，特別是對毒力和免疫原性的穩(wěn)定等進行進一步評價，更深入地了解各個疫苗菌株的特性，有效控制其毒力穩(wěn)定性和免疫原性，為家畜布魯氏菌病免疫預(yù)防提供更可靠的保障。

［1］Paranavitana C，Zelazow S E，Izad-Joo M，et al.Interferongamma associated cytokines and chemokines produced by spleen cells from Brucella-immune mice［J］.Cytokine，2005，30:86-92.

［2］Hamdy M E，El-Gibaly S M，Montasser A M.Comparison between immune responses and resistance induced in BALB/c mice vaccinated with RB51 and Rev1 vaccines and challenged with Brucella melitensis bv.3［J］.Vet Microbiol，2002，88:85-94.

［3］Moriyon I，Grillo M J，Monreal D，et al.Rough vaccines in animal brucellosis:Structural and genetic basis and present status［J］.Vet Res，2004，35:1-38.

［4］崔步云.中國布魯氏菌病疫情監(jiān)測與控制［J］.疫病監(jiān)測，2007，22(10):649-651.

［5］ 劉秉陽.布魯氏菌病學［M］.第1版.北京:人民衛(wèi)生出版社，1989:36.

［6］丁家波，張存帥，彭小兵，等.布魯氏菌種屬鑒定多重PCR方法的建立及初步應(yīng)用［J］.中國獸醫(yī)學報，2009，29(5):594-597.

［7］彭小兵，程君生，夏業(yè)才，等.多重PCR方法鑒別牛、羊、豬種布魯氏菌株［J］.中國獸藥雜志，2010，44(2):12-14.

［8］中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程［M］.二○○○年版.北京:化學工業(yè)出版社.154-160.

［9］Davis D S，Elzer P H.Brucella vaccines in wildlife［J］.Vet Microbiol，2002，90(11):533-544.

［10］Bosseray N.Brucella melitensis Rev.1 living attenuated vaccine:Stability of markers，residual virulence and immunogenicity in mice［J］.Biologicals，1991，19:355-363.

［11］ Grilló M J，Bosseray N，Blasco J M，et al.In vitro markers and biological activity in mice of seed lot strains and ommercial Brucella melitensis Rev.1 and Brucella abortus B19 vaccines［J］.Biologicals，2000，28:119-127.