優(yōu)化高氏Ⅰ號(hào)培養(yǎng)基在泰樂(lè)菌素菌種培養(yǎng)中的應(yīng)用

張 麗，張 萍，石彥鵬，馬 燕

(寧夏泰瑞制藥股份有限公司菌種研究所，銀川 750101)

泰樂(lè)菌素(Tylosin)是由弗氏鏈霉菌(Streptomyces fradiae)產(chǎn)生的一類大環(huán)內(nèi)酯禽畜專用抗生素。廣泛應(yīng)用于畜禽支原體疾病，細(xì)菌性疾病及螺旋體病和寄生蟲(chóng)病的防治。特別是其強(qiáng)烈的抗支原體特性，使其成為治療畜禽支原體病的首選藥物，而且對(duì)禽、畜的生長(zhǎng)有明顯促進(jìn)作用，并且不殘留［1］。被國(guó)內(nèi)外廣泛用作為飼料添加劑，是國(guó)家規(guī)劃重點(diǎn)發(fā)展的獸藥產(chǎn)品［2］。

在現(xiàn)有的泰樂(lè)菌素生產(chǎn)中，所用的斜面培養(yǎng)基多為麩皮培養(yǎng)基，而麩皮的質(zhì)量、品種的變化以及制作時(shí)不易掌握、甚至在每次配制時(shí)的煮沸、過(guò)濾等人為操作差異都會(huì)影響到斜面配比的穩(wěn)定。經(jīng)典的用于培養(yǎng)放線菌的高氏I號(hào)斜面培養(yǎng)基在斜面培養(yǎng)基配制中雖然質(zhì)量容易控制，較穩(wěn)定，但是斜面孢子生長(zhǎng)需14～15 d，周期長(zhǎng)，不太適合大規(guī)模生產(chǎn)。本文在原有高氏I號(hào)培養(yǎng)基配方中加入豆餅粉和酵母浸膏粉，通過(guò)單因子實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)［3］對(duì)斜面配方進(jìn)行優(yōu)化，能夠兼具麩皮斜面生長(zhǎng)快的優(yōu)勢(shì)，在生產(chǎn)中得到良好的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種 泰樂(lè)菌素產(chǎn)生菌 TLⅡ10-1222#由寧夏泰瑞制藥股份有限公司提供。

1.1.2 試劑及原料［4］麩皮(取本地產(chǎn)紅皮小麥自制)，氯化鈷(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司)，硫酸亞鐵、硫酸鋅、氯化鎂、氯化鈉、磷酸氫二鉀、硝酸鉀、硫酸鎂(均為天津市凱通化學(xué)試劑有限公司)，魚(yú)蛋白胨、酵母膏(北京奧博星生物技術(shù)有限公司)，酵母膏粉(英國(guó)進(jìn)口)，玉米淀粉(通良萬(wàn)順達(dá)生物科技有限公司)泰樂(lè)菌素標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)獸藥監(jiān)察所)，玉米漿(華北康欣)，豆餅粉(中寧縣天合工貿(mào)有限公司)，魚(yú)粉(吳忠玉環(huán)有限公司)，玉米粉(寧夏泰瑞制藥股份有限公司)，玉米蛋白粉(內(nèi)蒙阜豐)，氯化鉀(俄羅斯)，硫酸鎳(陵縣匯豐鈷業(yè))，鹽酸甜菜堿(濰坊祥維斯化學(xué)品有限公司)，磷酸氫二銨(什邡市百盛化工有限公司)，碳酸鈣(永登天玉化工有限公司)。

1.1.3 儀器與設(shè)備 旋轉(zhuǎn)搖瓶機(jī)，型號(hào)XDW25/96，四川長(zhǎng)征制藥機(jī)械廠;紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，型號(hào)752N，上海精密科學(xué)儀器有限公司;恒溫恒濕控制系統(tǒng)，型號(hào)BUH-03B/BUH-03A，蘇州市北冰洋空調(diào)設(shè)備有限公司、凈化工作臺(tái)，型號(hào)YJ-HS-2，無(wú)錫市榮豐凈化空調(diào)設(shè)備廠。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基

1.2.1.1 斜面培養(yǎng)基的制備:麩皮斜面培養(yǎng)基的制備，參見(jiàn)寧夏泰瑞制藥股份有限公司企業(yè)內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)。將麩皮用純化水煮沸30 min，過(guò)濾取汁，加入魚(yú)蛋白胨、氯化鈷、硫酸亞鐵、氯化鎂、硫酸鋅、瓊脂用純化水溶解后定容到所需體積，調(diào)pH為7.80～8.00，分裝于250 mL 茄瓶中，120 ℃滅菌30 min，冷卻至不燙手時(shí)鋪成斜面，凝固后，孵至表面無(wú)游離水。高氏I號(hào)斜面培養(yǎng)基的制備，將玉米淀粉用純化水溶解，加熱，糊化后，加入硝酸鉀、硫酸亞鐵、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、氯化鈉、酵母膏粉、豆餅粉、瓊脂用純化水溶解后定容到所需體積，調(diào)pH為7.20～7.40，分裝于 250 mL 茄瓶中，在 120 ℃、0.11MPa下滅菌30 min，冷卻至約50℃鋪成斜面，凝固后，孵至表面無(wú)游離水。

1.2.1.2 種子瓶培養(yǎng)基、發(fā)酵瓶培養(yǎng)基制備參見(jiàn)參考文獻(xiàn)［4］。

1.2.2 接種培養(yǎng) 取沙土管保藏的生產(chǎn)菌種適量，加生理鹽水制備成孢子懸浮液，用玻璃棒蘸取菌懸液在茄瓶?jī)?nèi)連續(xù)劃線，均勻密集地涂滿整個(gè)斜面。每種培養(yǎng)基各接斜面10瓶，置于恒溫室中培養(yǎng)，按照寧夏泰瑞制藥股份有限公司企業(yè)內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的條件分別培養(yǎng)至 7、8、9、10、11 d，分別觀察斜面孢子成熟度。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.3.1 在高氏I號(hào)斜面培養(yǎng)基中分別添加豆餅粉、酵母膏粉、玉米漿進(jìn)行單因子實(shí)驗(yàn)。

1.2.3.2 結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)高氏I號(hào)斜面培養(yǎng)基基礎(chǔ)配方中添加的酵母膏粉、豆餅粉及斜面孢子培養(yǎng)周期采用正交設(shè)計(jì)L25(56)的進(jìn)行優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 在高氏I號(hào)培養(yǎng)基(對(duì)照組)中分別添加不同比例的豆餅粉、酵母膏粉和玉米漿，并與高氏I號(hào)、麩皮培養(yǎng)基斜面孢子同期對(duì)比，以發(fā)酵搖瓶酸化液的化學(xué)效價(jià)為數(shù)據(jù)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)，其實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如下表1。

表1 豆餅粉、酵母膏粉和玉米漿加量在高氏培養(yǎng)基配方中的搖瓶效價(jià)

對(duì)比各實(shí)驗(yàn)組結(jié)果及t值，帶*組即添加玉米漿各實(shí)驗(yàn)組和高氏I號(hào)斜面組的平均效價(jià)低于麩皮斜面組，且t值均大于t界值表中相應(yīng)的 t值2.776 (α =0.05，t0.05/2，4)，其差異具有顯著性，可認(rèn)為添加玉米漿不利于泰樂(lè)菌素菌種培養(yǎng)，故在后續(xù)添加實(shí)驗(yàn)中舍去玉米漿各組。對(duì)豆餅粉和酵母膏粉的添加劑量和培養(yǎng)周期進(jìn)行正交設(shè)計(jì)，以確定最佳組合。

2.2 對(duì)高氏I號(hào)斜面培養(yǎng)基基礎(chǔ)配方中添加不同比例的豆餅粉(A)、酵母膏粉(B)及斜面孢子培養(yǎng)周期(C)按正交設(shè)計(jì)L25(56)進(jìn)行優(yōu)化，正交設(shè)計(jì)表如表2。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3。

表2 因素水平表

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，19號(hào)實(shí)驗(yàn)搖瓶效價(jià)最高，平均達(dá)到13959 u/mL，豆餅粉對(duì)搖瓶效價(jià)的影響比較大，為主要因子。通過(guò)直觀分析得出，斜面孢子培養(yǎng)基最優(yōu)配方和最佳培養(yǎng)周期為:A4B2C3，高氏I號(hào)培養(yǎng)基在基礎(chǔ)配方中添加1.0%豆餅粉和0.2%酵母膏粉，斜面培養(yǎng)至9 d效價(jià)最高，斜面孢子生長(zhǎng)均勻，壓片鏡檢孢子量大，大部分成游離孢子。

2.3 在培養(yǎng)至第9 d，分別對(duì)麩皮斜面和優(yōu)化后的高氏I號(hào)培養(yǎng)基上的菌種進(jìn)行壓片，經(jīng)美蘭染色后進(jìn)行顯微鏡觀察(放大倍數(shù):1000×)，發(fā)現(xiàn)在優(yōu)化后的高氏I號(hào)培養(yǎng)基上菌種成熟度明顯好于麩皮培養(yǎng)基，產(chǎn)生了大量的游離單孢子和鏈狀孢子，而麩皮培養(yǎng)基上仍為氣生菌絲。如圖1。

圖1 兩種培養(yǎng)基上菌種壓片鏡檢圖

3 討論

在高氏I號(hào)培養(yǎng)基基礎(chǔ)配方中添加1.0%豆餅粉和0.2%酵母膏粉，能夠明顯改善原高氏I號(hào)培養(yǎng)基生長(zhǎng)慢的現(xiàn)象，使斜面生長(zhǎng)周期縮短至9 d，產(chǎn)生大量?jī)?yōu)質(zhì)的孢子，夠達(dá)到麩皮培養(yǎng)基的菌體生長(zhǎng)的速度，而且搖瓶效價(jià)高于麩皮培養(yǎng)基斜面。同時(shí)其制備過(guò)程中簡(jiǎn)單，原材料質(zhì)量容易控制，有利于生產(chǎn)的穩(wěn)定。優(yōu)化后的高氏I號(hào)培養(yǎng)基完全可替代麩皮培養(yǎng)基用于生產(chǎn)。

［1］田國(guó)泰.泰樂(lè)菌素在畜禽業(yè)上的應(yīng)用［N］.中國(guó)畜牧水產(chǎn)報(bào)，2001-03-04:第7版.

［2］史小麗.泰樂(lè)菌素的性能與應(yīng)用［N］中國(guó)畜牧水產(chǎn)報(bào)，2001-09-30:第4版.

［3］ 張紹鏞，嚴(yán)圣武，等.質(zhì)量管理中的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法［M］.北京:北京理工大學(xué)出版社，1991:32-119.

［4］石彥鵬，張 麗，張 萍.硫酸亞鐵對(duì)泰樂(lè)菌素發(fā)酵的影響［J］.中國(guó)獸藥雜志［J］，2009，43(6):30-31.