豬支原體肺炎控制和凈化評價方法研究進展

華利忠，劉茂軍，馮志新，張小飛，邵國青

(1.江蘇省農業科學院獸醫研究所·農業部獸用生物制品工程技術重點實驗室·國家獸用生物制品工程技術研究中心，南京 210014;2.南京天邦生物科技有限公司，南京 211102)

豬支原體肺炎(Mycoplasma Pneumonia of Swine，MPS)防控和凈化是當今養豬業面臨的難題之一。臨床上主要依靠藥物控制、疫苗免疫以及改善飼養管理方式如全進全出、早期隔離斷奶，多點式生產模式等進行豬氣喘病的防控和凈化［1-3］。無論采用哪些方法，都必須建立相應的評價指標來衡量這些控制或凈化措施的效果，以便于豬場今后更好的控制豬支原體肺炎。目前，臨床上對豬支原體肺炎控制與凈化的評價指標主要有臨床癥狀，肺部肉變評分，生產指標(料肉比、出欄重、日增重等)，經濟效益等，如果涉及疫苗免疫，各項免疫學指標也是評價指標之一。

1 常規評價指標

1.1 臨床癥狀及發病率 豬支原體肺炎防控和凈化效果的評價，臨床癥狀和發病率是最表觀的指標。臨床癥狀主要包括咳嗽和呼吸困難兩項［4］。Nathues H等［5］對59個育肥豬群的咳嗽次數以及血清抗體和支氣管肺泡灌洗液病原檢出率進行了相關性分析，發現在育肥群中咳嗽次數的統計，尤其是干咳次數的統計有時可以替代Mhp的PCR病原檢測。劉茂軍等［6］在豬支原體肺炎活疫苗(168株)免疫效益的研究中，分別統計了哺乳期、保育期和育肥期的發病率，結果發現試驗的三個豬場三個時期免疫豬的發病率均顯著下降。國外所有豬肺炎支原體凈化成功的案例，無一例外均需對凈化后豬群乃至后代的臨床癥狀進行持續性的監測［7］，甚至還引進SPF級豬同群飼養，再觀測SPF級豬的臨床癥狀［8］，以達到更精確的結果。在國內，邵國青［9］建議無豬支原體肺炎健康豬場鑒定標準為:觀察3個月以上，未發現支原體肺炎癥狀并同時放入易感健康小豬2頭，同群飼養，也不被感染;一年之內整個豬群未發現支原體肺炎癥狀，檢查所宰殺的肥豬、淘汰豬、死亡豬的肺部均無喘氣病病變，實驗室PCR檢測病原陰性。可見發病率的降低是豬支原體肺炎防控效果的最主要指標之一。不僅是豬支原體肺炎本身，由于混合感染和繼發感染的存在，其他豬呼吸道疾病的發病率，特別是豬呼吸道疾病復合征發病率的降低，也可以作為評價豬支原體肺炎防控效力的主要臨床指標之一。

1.2 肺臟病變評分 肺臟肉變評分主要有55分法和28分法兩種(見圖1)。55分法即Goodwin評價法［10］，根據不同肺葉所占的比例進行病變程度打分，其中，每個心葉，尖葉最大值為10分，膈葉和副葉最大值為5分，最高55分。評定后將各肺葉評定的得分相加即為肺病變得分(不考慮各肺葉的大小)，分數越高，肺炎癥面積越大，損傷越嚴重，其中5分為輕微，10分為中度，15分為重度，20分為嚴重。28分法即Madec和Kobisch評分法［11］，是根據對7個肺葉病變程度按豬支原體肺炎特異性損傷的肺葉面積(其中副葉只觀察腹面，其他6個肺葉腹面和背面均需觀察)占該肺葉表面積的比例進行評定［11］，每個肺葉最高為4分，其中，無損傷為0，損傷面積占肺葉面積的1% ～25%為1分，26% ～50%為2分，51% ～75%為3分，大于75%為4分。各得分用如下公式進行計算總得分:(各肺葉背面觀察得分之和+各肺葉腹面觀察得分之和)/2+副葉觀察得分。最終結果進行四舍五入取整，最大得分為28分。肺部病變積分對于平均日增重和飼料轉化率有直接聯系，特別在與其它病原混合感染后可導致嚴重的肺部病變。這些評價系統可用于呼吸系統疾病的流行情況調查以及疫苗免疫效果評價。

圖1 肺臟肉變評分圖

1.3 效益核算 豬支原體肺炎控制和凈化的中效益核算指控制前后豬場所增加的收入和所增加的成本之差。其中成本的核算較為簡單，主要涉及所用的疫苗和藥物，增加的人工、設備和建筑，清群的豬群等。然效益的評估和計算較為復雜，其主要評價指標除了豬支原體肺炎及其他呼吸道疾病的發病率和死亡率的減少之外［11］，料肉比，平均日增重［13］和出欄時間也是評價豬支原體肺炎控制和凈化的主要指標之一。Bara［14］在進行瑞士減群法凈化豬支原體肺炎的評價中，統計了一個豬場凈化前后連續四年的平均日增重和出欄時間，發現四年內育肥豬的平均日增重從凈化前的585 g上升到713 g，出欄時間從凈化前的179 d下降到141 d，而每年豬氣喘病的控制和凈化費用從最初的每頭母豬87.2澳元/年逐漸下降到0澳元/年。Tzivara A等［15］將臨床癥狀，酮體重和出欄屠宰后的肺臟病變作為使用豬肺炎支原體滅活疫苗后的評價指標，結果發現兩個監測的豬場雖然未觀察到臨床癥狀，但免疫組比非免疫組的酮體重分別重6 kg和4 kg。這些數據表明料肉比，平均日增重和出欄時間作為豬支原體肺炎防控和凈化的效益指標比臨床癥狀的觀察更為精確。

1.4 血清學檢測 在未使用疫苗免疫的情況下控制和凈化豬支原體肺炎，血清中豬肺炎支原體特異性抗體的下降也可作為評價指標之一。Ciprián A等［4］在口服氟苯尼考控制人工感染豬肺炎支原體的療效研究中發現，口服氟苯尼考組的血清抗體在30日齡時相比未加藥物組顯著降低。Yeske E［16］采用全群注射泰拉菌素的方法凈化豬肺炎支原體的評價方法有臨床癥狀，育肥豬出欄前的血清抗體濃度，達到沒有臨床癥狀，血清抗體皆為陰性時判定為凈化成功。這些均表明在未使用疫苗免疫的情況下血清豬肺炎支原體特異性抗體濃度的降低可作為豬支原體肺炎控制和凈化效果的評價指標。

1.5 豬肺炎支原體病原檢測 豬支原體肺炎控制和凈化后，肺炎支原體病原的檢測是最根本的指標。病原檢測方法有各種PCR法，免疫組化法，免疫熒光法等等。其中套式PCR法和熒光定量PCR法檢測最為敏感，且樣品的采集部位有鼻拭子、口咽拭子、氣管拭子、氣管灌洗液和肺組織等多種［17］，可根據具體情況選擇不同的采樣部位進行采樣。Fablet C等［18］用鼻拭子、口咽拭子、支氣管拭子和支氣管肺泡灌洗液這四種方法對同一批豬進行活體采樣，分別用套式PCR和熒光定量PCR檢測豬肺炎支原體以探討四種方法的敏感性，發現支氣管拭子和支氣管灌洗液敏感性較前兩者高，說明檢測豬肺炎支原體，支氣管采樣是比較好的部位，但這兩種方法的樣品采集較為復雜，一般適合個體樣本的采集，群體樣本采集鼻拭子較為常用。Tamiozzo PJ［19］在瑞士減群法凈化豬肺炎支原體后對其后代的監測上，采用了血清抗體和病原檢測的評價指標，先間隔一定時間采集血清和鼻拭子分別進行ELISA和N-PCR檢測，到150日齡時屠宰豬如果發現有肺部病變，再用免疫組化法進行病原檢測，可見病原檢測在豬支原體肺炎控制和凈化評價指標的重要地位。

2 疫苗免疫后的免疫學評價方法

疫苗免疫是豬支原體肺炎控制和凈化的關鍵措施之一，臨床上也需要對疫苗使用前后的各項指標進行充分的評估和效益分析，才能更好的指導疫苗的臨床應用。除了上述常規評價方法之外，各種免疫學指標也是疫苗免疫獨特的評價內容。目前市場上有滅活疫苗和弱毒活疫苗兩種豬肺炎支原體疫苗，由于這兩種疫苗的主要免疫機理有所不同，故評價參數的側重點也有所不同。

2.1 滅活疫苗以體液免疫為主的評價方法 接種豬肺炎支原體滅活疫苗能夠降低肺炎的發生率、影響血清抗體生成量。Villarreal等［20］在5種豬肺炎支原體滅活疫苗免疫效果的研究中發現雖然所有疫苗組肺部肉變指數與對照組相比差異均不顯著，但這些苗均能引起豬肺炎支原體特異性抗體的升高。Reynolds SC等［21］在研究豬支原體肺炎滅活疫苗療效的試驗中，也發現無論是陰性場還是陽性場，用過疫苗的試驗組抗體滴度均比非免疫組高。這些結果均表明滅活疫苗免疫后以血清抗體的升高作為其主要評價指標較為敏感。雖然滅活苗依靠佐劑也能激發機體的細胞免疫，引起一些細胞因子的變化［22］，然而，檢測這些指標的代價昂貴，且針對性差，所以除人為試驗以外，臨床上基本不把細胞因子的變化作為豬肺炎支原體滅活疫苗免疫效果的評價指標。

2.2 弱毒活疫苗以黏膜免疫為主的評價方法

豬肺炎支原體弱毒活疫苗的免疫途徑為肺內注射，以激發機體的黏膜免疫和細胞免疫為主。Feng ZX等［23］建立了上呼吸道豬肺炎支原體特異性可溶性IgA(sIgA)的ELISA檢測方法，敏感度高，且鼻拭子采樣即可，操作簡單。后來Feng ZX等［24］通過動物實驗證明了免疫豬支原體肺炎活疫苗(168株)后sIgA濃度顯著升高，臨床癥狀及肺部病變顯著下降，說明sIgA可以作為評價弱毒活疫苗免疫效力的主要指標。

3 氣溶膠中豬肺炎支原體檢測指標的應用前景

作為呼吸道傳播的疾病，將氣溶膠檢測豬肺炎支原體作為豬場氣喘病的診斷和陰性群判定指標的研究已初見端倪。Dee S和Otake S等［25-27］都利用液體氣旋式采樣器檢測空氣中的Mhp氣溶膠，以此來判定豬肺炎支原體的陰陽性。所以豬場在豬支原體肺炎的防控和凈化中，如未用豬支原體肺炎弱毒活疫苗，豬舍單位體積空氣中的豬肺炎支原體濃度的下降可能可以作為豬支原體肺炎防控效果的評價指標之一。目前，豬肺炎支原體強毒株和商品化的豬支原體肺炎弱毒活疫苗(168株)的分子生物學鑒別診斷雖未見報道，但商品化弱毒疫苗豬支原體肺炎(168株)的全基因序列已經測出［28］，如能通過病原檢測的方法區分豬肺炎支原體野毒株和弱毒疫苗株(168株)，豬舍內氣溶膠中野毒株和疫苗株濃度的變化將可能成為一個較好的豬支原體肺炎弱毒活疫苗的免疫評價參數。

4 結語

豬場進行豬支原體肺炎的控制和凈化，其根本目的是經濟效益，所以進行各種防控措施前后，必須對防控措施的效益進行詳細的評估。不同防控措施的具體評價指標略有不同，以藥物控制為主要措施的評價指標有:豬支原體肺炎及其他呼吸道疾病的發病率和死亡率的減少，育肥豬平均日增重的增加，存欄時間的減少，血清抗體滴度的變化，豬肺炎支原體病原的減少等等。以疫苗免疫為主的評價指標除了上述指標之外，各種免疫學指標如血清抗體滴度，上呼吸道可溶性IgA濃度的增加等等。所以，進行經濟效益評價時一定要細致和全面，并進行必要的實驗室檢測。

［1］Maes D，Segales J，Meyns T，et al.Control of Mycoplasma hyopneumoniae infections in pigs［J］.Vet Microbiol，2008，126(4):297-309.

［2］Evans.Elimination of Mycoplasma hyopneumoniae and actinobacilus pleuropneumonia by“Swiss depopulation”combined with segregated medicated early weaning［C］.Proceedings of the 19th IPVS congress.Copenhagen，Denmark，2006:316.

［3］Alfonso A，Geiger J O，Freixes C.Mycoplasma hyopneumoniae and PRRSV elimination in a 1700 sow multi-site system［C］.Proceedings of the 19th IPVS congress.Copenhagen，Denmark，2006:174.

［4］Ciprian A，Palacios J M，Quintanar D，et al.Florfenicol feed supplemented decreasetheclinicaleffects ofMycoplasma hyopneumoniae experimental infection in swine in Mexico［J］.Res Vet Sci，2012，92(2):191-196.

［5］Nathues H，Spergser J，Rosengarten R，et al.Value of the clinical examination in diagnosing enzootic pneumonia in fattening pigs［J］.Vet J，2012，Inpress.

［6］劉茂軍，苗連葉，趙永前，等.豬支原體肺炎活疫苗(168株)臨床試驗［J］.畜牧與獸醫，2009，41(8):93-95.

［7］華利忠，馮志新，劉茂軍，等.瑞士減群法在豬肺炎支原體凈化中的應用研究進展［J］.中國農學通報，2012，28(14):73-78.

［8］Marco E，Quiroga M，Menjón R，et al.Eradication of Mycoplasma hyopneumoniae in a head using aivlosin［C］.Proceedings of the 20th IPVS Congress.Durban，South Africa:Hein jonker media management，2008:197.

［9］邵國青.豬喘氣病的控制與凈化方法的建議［J］.養豬，2010，(6):65-69.

［10］李祥健，劉有昌，趙東升.豬支原體肺炎免疫效果的評價［J］.今日養豬業，2009，(5):25-27.

［11］張 亞.基于黏膜免疫的Mhp間接ELISA檢測方法的建立及應用［D］.南京，南京農業大學，2011:21-30.

［12］Zimmermann W.Eradication of chronic lung diseases(EP ＆APP)of swine herds on a regional basis in Switzerland［M］.2005 Swine information CD-ROM.American association of swine veterinarians，2001:39-41.

［13］ Christiansen S，Szancer J.Attempt to eradicate Mycoplasma hyopneumoniae，actinobacillus pleuropneumoniae，and PRRS virus from an infected head by strategic medication［C］.Proceedings of the 19th IPVS congress.Copenhagen，Denmark，2006:315.

［14］Bará.Eradication of Mycoplasma pneumonia first reported Swiss depopulation in Australia［C］.Proceedings of the 17th IPVS Congress.Lowa，USA:2002:107.

［15］Tzivara A，Kritas S K，Bourriel A R，et al.Efficacy of an inactivated aqueous vaccine for the control of enzootic pneumonia in pigs infected with Mycoplasma hyopneumoniae［J］.Vet Rec，2007，160(7):225-229.

［16］Yeske P E.Mycoplasma eradication from an acute outbreak heard using DRAXXIN.(Tulathromycin)［C］.Proceedings of the 20th IPVS Congress.Durban，South Africa:Hein jonker media management，2008:110.

［17］張 旭，白方方，武昱孜，等.PCR技術檢測豬肺炎支原體研究進展［J］.生物技術通報，2012，(5):54-60.

［18］Fablet C，Marois C，Kobisch M，et al.Estimation of the sensitivity of four sampling methods for Mycoplasma hyopneumoniae detection in live pigs using a Bayesian approach［J］.Vet Microbiol，2010，143(2-4):238-245.

［19］Tamiozzo P J，Sernia C H，Carranza A I，et al.Monitoring the presence of Mycoplama hyopneumoniae in the offspring of sows on a farm that used the“Swiss Method”for mycoplasma hyopneumoniae eradication［C］.Proceedings of the 19th IPVS congress.Copenhagen，Denmark:Narayana Press，2006:398.

［20］Villarreal I，Vranckx K，Calus D，et al.Effect of challenge of pigs previously immunised with inactivated vaccinescontaining homo-logousand heterologous Mycoplasma hyopneumoniae strains［J］.BMC Vet Res，2012，8:2.

［21］Reynolds S C，St Aubin L B，Sabbadini L G，et al.Reduced lung lesions in pigs challenged 25 weeks after the administration of a single dose of Mycoplasma hyopneumoniae vaccine at approximately 1 week of age［J］.Vet J，2009，181(3):312-320.

［22］Procajlo Z，Srzweda W，Siwicki A K，et al.Indices of nonspecific and specific humoral immunity in pigs immunomodulated with the bioimmuno preparation and/or immunised with the respisure one vaccine against Mycoplasmal pneumonia of swine［J］.Pol J Vet Sci，2010，13(3):447-455.

［23］Feng Z X，Shao G Q，Liu M J，et al.Development and validation of a SIgA-ELISA for the detection of Mycoplasma hyopneumoniae infection［J］.Veterinary Microbiology，2010，143(2-4):410-416.

［24］Feng Z X，Shao G Q，Liu M J，et al.Immune Responses to the Attenuated Mycoplasma hyopneumoniae 168 Strain Vaccine by Intrapulmonic Immunization in Piglets.Agricultural Sciences in China［J］.2010，9(3):423-431.

［25］Dee S，Otake S，Deen J.Use of a production region model to assess the efficacy of various air filtration systems for preventing airborne transmission of porcine reproductive and respiratory syndrome virus and Mycoplasma hyopneumoniae:results from a 2-year study［J］.Virus Res，2010，154(1/2):177-184.

［26］Dee S，Otake S，Oliveira S，et al.Evidence of long distance airborne transport of porcine reproductive and respiratory syndrome virus and Mycoplasma hyopneumoniae［J］.Vet Res，2009，40(4):39.

［27］Otake S，Dee S，Corzo C，et al.Long-distance airborne transport of infectious PRRSV and Mycoplasma hyopneumoniae from a swine population infected with multiple viral variants［J］.Vet Microbiol，2010，145(3/4):198-208.

［28］Liu W，Feng Z X，Fang L R，et al.Complete genome sequence of Mycoplasma hyopneumoniae strain 168［J］.J Bacteriol，2011，193(4):1016–1017.