補腎益智顆粒的質量標準研究

周娟 張艷平 王奇 陳云波 胡英杰

廣州中醫藥大學，廣東廣州 510405

補腎益智顆粒的質量標準研究

周娟 張艷平 王奇 陳云波 胡英杰▲

廣州中醫藥大學，廣東廣州 510405

目的建立補腎益智顆粒的質量標準研究。方法采用薄層色譜法對補腎益智顆粒中的蛇床子、女貞子和制何首烏進行定性鑒定，采用高效液相色譜法對其中蛇床子素和2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷含量進行測定。對于蛇床子素，高效液相色譜系統是由Phenomenex Luna C18（250mm×4.6mm，5μm），乙腈-水（65∶35）為流動相，流速為1.0 mL/min，檢測波長為322 nm。對于葡萄糖苷，高效液相色譜系統包括C18（250 mm×4.6 mm，5μm)，甲醇-水（30:70）為流動相，流速為1.0mL/min，檢測波長為320 nm。結果補腎益智顆粒的蛇床子、女貞子和制何首烏供試品薄層色譜中，在與對照品色譜相應位置上，顯相同顏色的斑點；蛇床子素在0.09～1.35μg范圍內與峰面積積峰值線性關系良好（r=0.999 9）。2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷（二苯乙烯苷）在0.84～3.15μg范圍內與峰面積線性關系良好（r=0.999 9）。平均回收率分別為100.52%和99.75%。結論建立的質控方法簡便，快速，準確，回收率高，重現性好，可用于補腎益智顆粒的質量控制。

補腎益智顆粒；薄層色譜法；高效液相色譜法；蛇床子；女貞子；制何首烏；質量標準

補腎益智顆粒是我校臨床藥理研究所研制的中藥新藥，由蛇床子、女貞子、何首烏等7味中藥組方而成，具有補腎益智、益氣養血之功效。通過十幾年的潛心研究，無論在AD細胞模型的體外機制實驗中[1-3]，還是阿爾茨海默病大鼠模型的體內藥理試驗中[4-6]，都很好地證實了其對治療老年癡呆癥有良好的療效。補腎益智顆粒是有良好臨床應用前景的中藥新藥，因此有必要建立規范的質量標準，此次實驗以復方中蛇床子、女貞子、何首烏為目標藥材，選取蛇床子中蛇床子素、女貞子中齊墩果酸、何首烏中二苯乙烯苷為指標成分，參照《中國藥典》2010年版，建立制劑質量標準。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

戴安高效液相色譜儀（泵，P680；檢測器，PDA-100；進樣器，Ultimate3000；柱溫箱，TCC-100；工作站，Chromeleon）；色譜柱：Phenomenex Luna C18（250mm×4.6mm，5μm）。Sartorius萬分之一電子分析天平（BS224S）。

1.2 試藥

中藥化學對照品和對照藥材由中國藥品生物制品檢定所提供；包括蛇床子素（批號110822-200407）、齊墩果酸（批號111575-200502）、2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷（批號：10844-201009）、何首烏對照藥材（批號：120934-201009）乙腈及甲醇為色譜純（DIKMA TECHNOLIGIC INC.），水為自制超純水；其他試劑均為分析純。補腎益智顆粒（批號：20120123、20120126）及藥材陰性對照樣品（按處方除去該被測藥材后同法制劑）為自制。

1.3 供試樣品

取本品研細粉，稱重，加100倍量50%甲醇，超聲處理（功率250W，頻率25 kHz）1 h，離心，取上清液減壓蒸除甲醇，繼續蒸發制成水煎濃縮液（1 mL=1 g藥材），即為本品濃縮液。

2 方法與結果[7]

2.1 藥材的TLC鑒別

2.1.1 蛇床子

2.1.1.1 供試品液制備取本品濃縮液2mL，加水稀釋至10mL，加石油醚，振搖提取3次，每次10 mL，合并石油醚液，減壓蒸干，殘渣加甲醇1mL溶解，即得。

2.1.1.2 對照品液制備取蛇床子素對照品適量，加甲醇制成每毫升含1mg的溶液，即得。

2.1.1.3 陰性對照品液制備取缺蛇床子的本品水煎濃縮液，按“2.1.1.1”項下方法制備成陰性對照品液。

2.1.1.4 薄層色譜鑒別吸取供試品液、對照品液和陰性對照品液各5μL，分別點于同一塊硅膠GF薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-環己烷（3∶2∶2）為展開劑，展開，取出，晾干，在紫外光燈波長365 nm下檢測。結果，供試品薄層色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同熒光的斑點，陰性樣無干擾。見圖1。

2.1.2 女貞子

2.1.2.1 供試品液的制備取“2.1.1.1”項下石油醚的萃余相，加二氯甲烷振搖提取3次，每次10mL，合并二氯甲烷液，減壓蒸干，殘渣加甲醇1mL溶解，即得。

2.1.2.2 對照品液的制備取齊墩果酸對照品適量，加甲醇制成每毫升含1mg的溶液，即得。

2.1.2.3 陰性對照品液的制備取缺女貞子的本品水煎濃縮液，按“2.1.2.1”項下方法制備成陰性對照品溶液。

2.1.2.4 薄層色譜鑒別吸取供試品液、對照品液和陰性對照品液各5μL，分別點于同一塊硅膠G薄層板上，以環己烷-丙酮-乙酸乙酯（5∶2∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色。結果供試品色譜中，在與齊墩果酸對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性樣無干擾。見圖2。

2.1.3 制何首烏

2.1.3.1 供試品液的制備取“2.1.2.1”項下二氯甲烷的萃余相，加正丁醇振搖提取3次，每次10mL，合并正丁醇部位，減壓蒸干，殘渣加甲醇1mL溶解，即得。

2.1.3.2 對照品溶液的制備取何首烏對照藥材粉末0.25 g加甲醇50 mL，超聲處理（功率250W，頻率25 kHz）0.5 h，過濾，洗滌殘渣，合并濾液，減壓濃縮，殘留液加乙醇定容至2mL，即得。

2.1.3.3 陰性對照品溶液的制備取缺何首烏子的本品水煎濃縮液，按“2.1.3.1”項下方法制備成陰性對照品溶液。

2.1.3.4 薄層色譜鑒別吸取供試品液、對照品液和陰性對照品液各5μL，分別點于同一塊羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠H薄層板上，以甲苯-乙醇（4∶2.5）為展開劑，展開約4 cm取出，晾干；再以甲苯-乙醇（4∶0.8）為展開劑，展至約7 cm，至紫外光燈波長365 nm下顯熒光斑點。結果，供試品色譜中，在與何首烏對照藥材對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，陰性樣品無干擾。見圖3。

2.2 含量測定

2.2.1 蛇床子素的含量測定

2.2.1.1 色譜條件色譜柱：Phenomenex Luna C18（250mm×4.6mm， 5μm）；流動相為乙腈-水（65∶35）；檢測波長為322 nm。理論板數按蛇床子素峰計算，應不低于4 000。見圖4。

2.2.1.2 對照品溶液的制備取蛇床子素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每毫升含45μg的溶液，即得。

2.2.1.3 供試品溶液的制備精密吸取本品濃縮液5 mL，置50 mL容量瓶中，加稀乙醇至刻度，精密稱定，超聲處理（功率250W，頻率25 kHz）30min，放冷，補足失重，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.2.1.4 陰性對照品液制備取缺蛇床子的本品水煎濃縮液，按“2.2.1.3”項下方法制備成陰性對照品液。

2.2.1.5 線性關系考察分別吸取對照品溶液2、4、6、8、10、15、20、25、30μL，注入色譜儀并記錄色譜圖，將進樣量與峰面積進行回歸處理，得回歸方程為：A=108.116 3X-2.765 3，r=0.999 9。結果表明蛇床子素在0.09～1.35μg范圍內與峰面積呈良好線性關系。

2.2.1.6 精密度試驗取對照品溶液，連續進樣6次，記錄峰面積，RSD為0.32%，表明進樣精密度良好。

2.2.1.7 重復性試驗精密吸取同批供試品6份（批號：20120126），測定。結果含量為0.188 1mg/g，RSD為1.5%，表明方法重現性良好。

2.2.1.8 穩定性試驗分別于0、2、4、6、8、12 h精密吸取供試品（批號：20120123）溶液10μL，進樣，測定蛇床子素的峰面積，結果峰面積RSD為0.99%。表明供試品溶液在12 h內穩定。

2.2.1.9 加樣回收率試驗精密吸取已知含量（蛇床子素0.172 9mg/g）的補腎益智方濃縮液（批號：20120126）9份，各2.5 mL，按低、中、高質量濃度分別精密加入蛇床子素（相當于0.35、0.45、0.52 mg），每個濃度3份，依法制備供試液，測定，蛇床子素的回收率為100.52%，RSD為1.7%，表明方法回收率良好。見表1。

表1 回收率試驗測定結果

2.2.1.10 樣品含量測定取供試品兩批制成供試品溶液，取供試品溶液10μL，依法測定，結果兩批樣品中蛇床子素含量。見表2。

表2 樣品蛇床子素含量測定結果（±s，n=3）

表2 樣品蛇床子素含量測定結果（±s，n=3）

批號蛇床子素（mg/g）RSD（%）20120123 20120126 0.190±0.004 0.180±0.003 2.3 1.9

2.2.2 二苯乙烯苷的含量測定

2.2.2.1 色譜條件色譜柱：Phenomenex LunaC18（250mm×4.6mm，5μm）；流動相為甲醇-水（25∶75）；檢測波長為320 nm。理論板數按二苯乙烯苷峰計算應不低于3 000。避光操作。見圖5。2.2.2.2對照品溶液的制備取2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每毫升含0.2mg的溶液，即得。

2.2.2.3 供試品溶液的制備取蛇床子測定項下的供試品溶液，即得。

2.2.2.4 陰性對照品液制備取缺制何首烏的本品水煎濃縮液，按“2.2.2.3”項下方法制備成陰性對照品液。

2.2.2.5 線性關系考察分別吸取對照品溶液4、6、8、10、12、15μL，注入色譜儀并記錄色譜圖，將進樣量與峰面積進行回歸處理，回歸方程為：A=23.318 7X+32.994 7，r=0.999 9。結果表明二苯乙烯苷在0.84～3.15μg范圍內與峰面積呈良好線性關系。

2.2.2.6 精密度試驗取對照品溶液，連續進樣5次，記錄峰面積，RSD為0.32%，說明進樣精密度良好。

2.2.2.7 重復性試驗精密稱取同批供試品5份（批號：20120123），測定。結果含量為1.88 mg/mL，RSD為1.3%，表明方法重現性良好。

2.2.2.8 加樣回收率試驗精密稱取已知含量二苯乙烯苷1.88mg/g的補腎益智顆粒（批號：20120123）濃縮液9份，各2.5mL，按低、中、高質量濃度分別精密加入二苯乙烯苷（相當于1.8、2.0、 2.5mg），每個濃度3份，依法制備供試液，測定，二苯乙烯苷的回收率為99.75%，RSD為2.1%，表明方法回收率良好。見表3。

表3 回收率試驗測定結果

2.2.2.9 樣品含量測定取供試品2批制成供試品溶液，取供試品溶液10μL，依法測定，結果3批樣品中二苯乙烯苷含量。見表4。

表4 樣品二苯乙烯苷含量測定結果（±s，n=3）

表4 樣品二苯乙烯苷含量測定結果（±s，n=3）

批號二苯乙烯苷（mg/g）RSD（%）20120126 20120223 1.86±0.03 1.89±0.05 1.62 2.70

3 討論

補腎益智顆粒系經水提醇沉工藝提取、精制而成。故取其細粉用含水甲醇進行處理，并制成濃縮液用于質控方法研究。利用擬定的TLC條件，對蛇床子、女貞子和制何首烏三味藥材進行定性鑒別，展開效果良好，斑點清晰。

鑒于蛇床子素可通過影響癡呆型動物模型學習記憶能力、腦內神經遞質及自由基損傷表現出防治AD的作用[8]；補腎益智方含藥血清能在一定程度上抑制Aβ25-35對細胞的損傷作用，并且經拆方研究發現以蛇床子為主的補腎組和以何首烏為主的補腎組有不同的藥理作用，且有協同作用[9-10]，因此選取蛇床子的蛇床子素和制何首烏的2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷兩個成分作為質控的指標成分，用高效液相色譜法進行可能的有效成分定量質控方法研究。經方法學考察，證明本研究所建立的含量測定方法具有回收率高、重現性好、簡便、迅速、準確的特點，可用于補腎益智顆粒質量控制。

[1]鐘振國，賴世隆，劉茂才，等.補腎益智方對AD細胞模型影響的研究[J].現代中西醫結合雜志，2002，15（7）：76-79.

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[3]程淑意，陳云波，王靖吉.補腎益智方含藥血清保護Aβ25-35-3損傷PC12細胞的實驗研究[J].新中醫，2010，42（5）：102-104.

[4]高潔，賴世隆，饒燕.補腎益智方對Alzheimer病模型大鼠腦內β-淀粉樣前體蛋白的影響[J].中國中西醫結合雜志，2002，22（9）：677-679.

[5]饒燕，賴世隆，胡鏡清，等.補腎益智方對老年性癡呆大鼠突觸傳遞長時程增強的影響[J].廣州中醫藥大學學報，2000，17（2）：109-112.

[6]張魁華，賴世隆，胡鏡清，等.補腎益智方對老年性癡呆模型大鼠海馬結構生長抑素神經元的影響[J].廣州中醫藥大學學報，2001，18（1）：25-29.

[7]國家藥典委員會.中國藥典[S].一部.北京：中國醫藥科技出版社，2010：43，164-165，295-296.

[8]吳蕾，程淑意，王奇，等.中藥有效成分防治阿爾茨海默病的藥理研究進展[J].中國中藥雜志，2004，29（5）：387-389.

[9]羅曉莉.補腎益智方體內移行成分-蛇床子素的含量測定級藥動學研究[D].廣州：廣州中醫藥大學，2010.

[10]陳云波，賴世隆，胡鏡清，等.補腎益智方拆方含藥血清保護Aβ25-35損傷NG108-15細胞的研究[J].中國實驗方劑學雜志，2002，8（5）：27-30.

Study on quality standard for Bushen YizhiGuanules

ZHOU Juan ZHANG Yanping WANGQi CHEN Yunbo HU Yingjie▲
Guangzhou University of Chinese Medicine,Guangdong Province,Guangzhou 510405,China

ObjectiveTo establish a quality standard for Bushen Yizhi Granules.MethodsTLC techniques were used to indentify Cnidii Fructus,Ligustri Lucidi Fructus and Preparata PolygoniMultiflori Radix.The contents of osthole of Cnidii Fructus,and 2,3,5,4′-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside(stilbene glycoside)of Preparata Polygoni Multiflori Radixwere both determined by HPLC.For osthole,HPLC system was consisted of Phenomenex Luna C18(250mm×4.6mm, 5μm),acetonitrile-water(65∶35)was used asmobile phase,with the flow rate of 1.0 mL/min,detection wavelength was 322 nm.And for stilbene glucoside,the HPLC system consisted of C18(250mm×4.6mm,5μm),methanol-water(30:70)as mobile phase,flow rate of 1.0 mL/min,detection wavelength at 320 nm.ResultsThe methods of TLC were simple with strong specificity and good reproducibility.The results of HPLC showed that calibration curve was linear in the ranges of 0.09-1.35μg(r=0.999 9)for osthole,and 0.84-3.15μg(r=0.999 9)for stilbene glycoside.The average recovery rate was 100.52%and 99.75%,respectively.ConclusionThemethod established is simple,accurate and suitable for the quality control Bushen YizhiGranuls.

Bushen Yizhi Granules;TLC;HPLC;Cnidii Fructus;Ligustri Lucidi Fructus;Preparata Polygoni Multiflori Radix;Quality standard

R285.5

A

1673-7210（2012）11（c）-0113-04

2010年度高等學校博士學科點專項科研基金（項目編號：20104425110014）；廣東省科技計劃項目（項目編號：2010A030100009）。

周娟（1984-），女，廣州中醫藥大學2009級中藥學碩士研究生。

▲通訊作者

2012-07-09 本文編輯：衛軻）