結直腸癌中Runx3基因啟動子區甲基化狀態及其表達研究

劉康兵，楊振平，羅紀紅 (石首市中醫醫院腫瘤科，湖北 石首 434400)

結直腸癌中Runx3基因啟動子區甲基化狀態及其表達研究

劉康兵，楊振平，羅紀紅 (石首市中醫醫院腫瘤科，湖北 石首 434400)

目的：觀察結直腸癌中Runx3基因啟動子區域甲基化狀態及Runx3基因表達情況，探討Runx3基因啟動子區域異常甲基化狀態在結直腸癌發生和發展過程中的意義。方法：采用DNA甲基化特異性PCR(MSP)技術分別對7種結直腸癌細胞系和65例結直腸癌患者腫瘤組織及其癌旁組織Runx3基因啟動子區域甲基化進行檢測，同時采用逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測結直腸癌細胞系及腫瘤組織、癌旁組織中Runx3基因表達情況。結果：在結直腸癌組織中，Runx3基因啟動子區域甲基化率占43.1%(28/65)，而在相對應的癌旁正常組織中，Runx3基因啟動子區域未發現高甲基化現象；在7種結直腸癌細胞系中，有6種細胞Runx3基因啟動子區域存在過度甲基化異常；RT-PCR結果顯示，7種結直腸癌細胞系中僅Caco-2細胞中出現Runx3基因表達，而65例結直腸癌標本中，Runx3 mRNA表達率為49.2%(32/65)，其表達情況與腫瘤分化程度、Dukes分期及淋巴結轉移等臨床病理參數之間存在顯著相關性。結論：Runx3基因啟動子區域甲基化是導致Runx3基因失活的主要原因之一，與結直腸癌發生密切相關，可作為結直腸癌早期診斷的分子標記物及分子治療的靶點。

結直腸癌；Runx3基因；甲基化；表達

人類Runx3基因位于1號染色體的1p36.1,基因全長約67kb,含有p1和p2兩個啟動子、6個外顯子和1290kb的開放閱讀框[1]，其表達產物約由415個氨基酸殘基組成，RUNX3蛋白在TGF-β介導的細胞周期調控、細胞分化與凋亡過程中發揮重要作用[2]，近年來多種研究發現Runx3異常表達與人類多種消化系腫瘤的發生密切相關[3]。據Ku等[4]報道，結直腸癌中啟動子區域的高度甲基化是Runx3基因失活的主要機制，從而導致TGF-β/SMADS信號通路削弱或信號轉導障礙，影響細胞分化和凋亡。本研究中我們檢測了結直腸癌細胞系和結直腸癌組織中Runx3基因啟動子區甲基化狀態和表達情況，旨在闡明Runx3基因啟動子區域甲基化異常與結直腸癌發生、發展過程的關系，從而探討Runx3基因可能成為結直腸癌早期診斷和治療的分子標記物。

1 對象與方法

1.1對象

65例結直腸癌組織及相對應的癌旁正常組織取自湖北省腫瘤醫院、荊州市第一人民醫院和石首市中醫院腫瘤科2005年8月至2008年5月手術切除標本，所選取的結直腸癌患者術前均未實施放療或化療，患者年齡35～76歲，平均年齡52.8歲，其中男54例，女11例。所取組織離體后立即一分為二，一份先置于液氮中速凍10min,然后置于-80℃冰箱中保存。另一份以40g/L甲醛溶液固定，制作常規病理切片，通過HE染色，確定病理診斷。

1.2基因組DNA提取及甲基化PCR(MSP)

利用常規酚/氯仿抽提法提取DNA,參照MSP方法[5]對稀釋的DNA進行預處理，兩對Runx3基因的甲基化引物和非甲基化引物設計和PCR反應參見文獻[6]。

1.3MSP結果判斷

在MSP結果中，僅甲基化引物能擴增出目的帶型，表明Runx3基因啟動子區域過度甲基化；如甲基化引物和非甲基化引物都能擴增出目的帶型，表明Runx3基因啟動子區域處于部分甲基化狀態；僅非甲基化引物能擴增出目的帶型，表明Runx3基因啟動子區域未甲基化。

1.4總RNA抽提及RT-PCR

收集細胞后，總RNA抽提及RT-PCR參見文獻[7]。

1.5統計學分析

利用SPSS11.0軟件對Runx3 mRNA表達情況與臨床病理資料之間進行統計學分析，采用χ2檢驗分析不同組別Runx3 mRNA表達情況。Plt;0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

M:250bp梯度標準DNA分子量m:甲基化；u:未甲基化。

2.1Runx3基因在結直腸癌細胞中甲基化狀態及表達情況

在7種結直腸癌細胞(以胃癌細胞SNU-1、SNU-5為參照)中，僅Caco-2細胞中Runx3基因啟動子區部分甲基化，其余6種結直腸癌細胞中Runx3基因啟動子區都呈現過度甲基化現象(圖1)。利用RT-PCR方法檢測結直腸癌細胞Runx3基因表達情況顯示，僅Caco-2細胞中出現Runx3基因表達(圖2)。

2.2Runx3基因在結直腸癌組織中甲基化狀態分析

在65例結直腸癌組織中,Runx3基因啟動子區甲基化率約占43.1%(28/65)，其中部分甲基化狀態占18.5%(12/65)，而在相對應的癌旁正常組織中，Runx3基因啟動子區域未發現過度甲基化現象(圖3),兩者比較具有統計學差異(Plt;0.05)。

M:250bp梯度標準DNA分子量。

M:250bp梯度標準DNA分子量；m:甲基化；u:未甲基化；N：正常結直腸組織；T：結直腸癌組織；

2.3Runx3mRNA在結直腸癌組織中的表達及其與臨床病理參數的關系

在65例結直腸癌標本中，Runx3 mRNA表達率為49.2%(32/65)，不表達的標本約為50.8%(33/65)，且Runx3基因啟動子區過甲基化的12例結直腸癌標本中Runx3 mRNA全部不表達，而在相應的癌旁組織中，Runx3 mRNA全部表達(見表1)。結直腸癌組織與癌旁組織之間存在統計學差異(Plt;0.05)。結直腸癌組織中Runx3 mRNA表達情況與患者年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤大小、腫瘤組織學類型等臨床病理參數無關(Pgt;0.05)，而與腫瘤分化程度、Dukes分期及淋巴結轉移等臨床病理參數有關(Plt;0.05)。

3 討 論

癌基因的激活和(或)抑癌基因的失活是結直腸癌發生、發展的分子生物學基礎，新型抑癌基因Runx3廣泛表達于消化道上皮細胞、血液細胞、間葉細胞、神經細胞等[8-9]。Runx3基因是Runx家族中最近受到廣泛研究的基因，是哺乳動物runt家族進化的基礎[10]，其產物通過指導TGF-β信號轉導，從而對細胞分化、細胞周期調控、細胞凋亡等起著重要的作用。Runx3基因失活或下調表達的機制目前認為可能與基因缺失和甲基化相關[11]，而腫瘤細胞中Runx3基因啟動子區CpG島的甲基化是其失活的主要原因[12]。

表1 結直腸癌組織中Runx3 mRNA表達情況與臨床病理參數的關系

Runx3基因的5'端啟動子及附近存在4.2kb的CpG島,其GC含量約高達64%，這種結構表明該基因可能受甲基化的調控[9]。許多研究表明，Runx3基因在胃癌、肝細胞癌、膽道腫瘤、肺癌、嬰兒睪丸內胚竇瘤等人類多種腫瘤中存在啟動子區域甲基化異常[1，13-16]，在結直腸癌中也有報道[17]，這是抑癌基因Runx3失活的主要機制。本研究通過運用MSP技術對7種結直腸癌細胞系和65例結直腸癌患者癌組織Runx3基因啟動子區甲基化情況進行研究顯示，7種結直腸癌細胞中，僅Caco-2細胞中Runx3基因啟動子區部分甲基化，其余6種結直腸癌細胞中Runx3基因啟動子區都呈現過度甲基化現象；65例結直腸癌組織中Runx3基因啟動子區甲基化率約占43.1%(28/65)，其中部分甲基化狀態占18.5%(12/65)，而在相對應的癌旁正常組織中，Runx3基因啟動子區域未發現過度甲基化現象[18]，兩者比較具有統計學差異(Plt;0.05)。MSP實驗結果表明，Runx3基因啟動子區過度甲基化現象是結直腸癌中常見的表觀遺傳事件，可能參與了結直腸癌的發生發展過程。我們通過RT-PCR方法分析了7種結直腸癌細胞系和65例結直腸癌患者癌組織及癌旁組織中Runx3 mRNA表達情況。在結直腸癌細胞系中，僅Caco-2細胞中出現Runx3基因表達，其表達結果與MSP實驗結果相符；在65例結直腸癌組織中，Runx3 mRNA表達率為49.2%(32/65)，不表達的標本約為50.8%(33/65)，且Runx3基因啟動子區過甲基化的12例結直腸癌標本中Runx3 mRNA全部不表達，而在相應的癌旁組織中，Runx3 mRNA全部表達，結直腸癌組織與癌旁組織之間存在統計學差異(Plt;0.05)。RT-PCR結果顯示，結直腸癌中Runx3基因啟動子區甲基化現象與其mRNA表達下調保持一致。通過研究結直腸癌組織中Runx3 mRNA表達情況與臨床病理參數的關系顯示，Runx3 mRNA表達情況與患者年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤大小、腫瘤組織學類型等臨床病理參數無關(Pgt;0.05)，而與腫瘤分化程度、Dukes分期及淋巴結轉移等臨床病理參數之間存在顯著相關性(Plt;0.05)。

本實驗的研究結果表明，Runx3基因啟子區CpG島的高甲基化在結直腸癌的發病過程中是一種常見的表觀遺傳學事件，而Runx3作為一個腫瘤抑制基因，其表達下調參與了結直腸癌的發生、發展，并可能與結直腸癌的分化程度、病理分期及淋巴結轉移密切相關。在此基礎上進一步研究Runx3基因在結直腸癌發生發展過程中的作用將可作為結直腸癌早期診斷的分子標記物及分子治療的靶點。

[1]張海元，劉娟，解庭波.肝細胞癌中Runx3基因啟動子區甲基化研究[J].華中科技大學學報：醫學版，2009，38(1)：23-26.

[2]張海元，云鵬.肝癌細胞系中Runx3基因表達及啟動子區異常甲基化分析[J].長江大學學報：自科版醫學卷，2009，6(1)：1-3.

[3]曾超，賀修勝.Runx3基因與消化系統惡性腫瘤的關系[J].國外醫學：腫瘤分冊，2005，32(2)：128-131.

[4]Ku J L，Kang S B，Shin Y K，et al.Promoter hypermethylation downregulates RUNX3 gene expression in colorectal cancer cell lines[J].Oncogene，2004，23(40)：6736-6742.

[5]James G，Heman，Jeremy R，et al.Methylation-specific PCR：A novel PCR assay for methylation status of CpG islands[J].Proc Natl Acad Sci USA，1996，93：9821-9826.

[6]何小兵.胃癌細胞系Runx3基因甲基化狀態及臨床意義[J].長江大學學報：自科版醫學卷， 2008，5(4)：16-18.

[7]何小兵，張海元，王衛政.胃癌中Runx3基因甲基化表達及臨床研究[J].長江大學學報：自科版醫學卷，2009，6(2)：16-19.

[8]Woolf E，Xiao C，Fainaru O，et al.Runx3 and Runx1 are required for CD8 T cell development during thymopoiesis[J].Proc Natl Acad Sci USA，2003，100(13)：7731-7736.

[9]Levanon D，Bettoun D，Harris-Cerruti C，et al.The Runx3 transcription factor regulates development and survival of Trk C dorsal root ganglia eurons[J].EMBO J，2002，1(13)：3454-3463.

[10]Bangsow C，Rubins N，Glusman G，et al.The RUNX3 gene sequence structure and regulated expression[J].Gene，2001，279：221-232.

[11]Tozawa T，Tamura G，Honda T，et al.Promoter hypermethy lation of DAP-kinase is associated with poor survival in primary biliary tract carcinoma patients[J].Cancer Sci，2004，95(9) ：736-740.

[12]Kato N，Tamura G，Fukase M，et al.Hypermethylation of the Runx3 gene promoter in testicular yolk sac tumor of infants[J].Am J Pathol，2003，163(2) ：387-391.

[13]Sato K，Tomaizawa Y，Lijima H，et al.Epigenetic inactivation of the RUNX3 gene in lung cancer[J].Oncol Rep，2006，15(1)：129-135.

[14]Tomohiro Tozawa，Gen Tamura，Teiichiro Honda，et al.Promoter hypermethylation of DAP-kinase is associated with poor survival in primary biliary tract carcinoma patients[J].Cancer Sci，2004，95：736-740.

[15]張海元，熊維，任松森.肝細胞癌中Runx3基因表達狀態分析及預后評估價值的研究[J].長江大學學報：自然科學版醫學卷，2010，7(3)：15-17.

[16]Noriko Kato，Gen Tamura，Masayuki Fukase，et al.Hypermethylation of the RUNX3 Gene Promoter in Testicular Rolk Sac Tumor of Infants[J].American Journal of Pathology，2003，163：387-391.

[17]Ajay Goel，Takeshi Nagasaka，Christian N，et al.The CpG island methylator phenotype and chromosomal instability are inversely correlated in sporadic colorectal cancer[J].Gastroenterology，2007，132(1)：127-138.

[18]何小兵，張海元.胃癌及癌旁組織中Runx3基因甲基化研究及臨床意義[J].吉林醫學，2012，33(2)：227-228.

[編輯]一 凡

10.3969/j.issn.1673-1409(R).2012.03.003

R735.5；R730.231

A

1673-1409(2012)03-R006-04

2012-01-16

湖北省教育廳中青年項目(020091207)

劉康兵(1974-)，男，湖北石首人，主治醫師，主要從事腫瘤基礎與臨床研究工作。