GLP-1類似物對糖尿病心肌病大鼠心臟組織PPAR-α、ET-1表達的影響

侯 敏 楊 靜

(山西醫科大學，山西 太原 030012 )

1 材料與方法

1.1 材料

Exendin-4：購自東莞寶麗健生物工程研究開發有限責任公司STZ：購自 Sigma DAB顯色劑：購自武漢博士德生物有限公司PPAR-α：購自武漢博士德生物有限公司ET-1：購自北京博奧森生物技術有限公司聚合HRP標記抗兔IgG：購自武漢博士德生物有限公司Masson染液：購自南京建成科技有限公司

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型建立和分組

8周齡健康雄性SD大鼠30只，體質量（180±20）g，高糖高脂喂養四周后以40mg/kg的劑量腹腔內注射STZ溶液 （將STZ溶于濃度為0.1mol/L，pH為4.4的檸檬酸鹽緩沖液）制備糖尿病模型，注射7d后取大鼠尾靜脈血測血糖（強生血糖儀檢測），定期隨機測大鼠血糖觀察血糖變化，測血糖值均＞16.67mmol/L，則糖尿病模型建立。常規喂養四周后隨機分為糖尿病心肌病組（皮下注射等量的PBS緩沖液）、小劑量治療組（皮下注射4μg/kg Exendin-4）、大劑量治療組（皮下注射20μg/kg Exendin-4），共治療6周后處死大鼠，腹腔靜脈采血測血脂四項（貝克曼LX-2000全自動分化分析儀），取出心臟，切取心室肌組織進行病理檢測和免疫組織化學染色（造模過程中4只死亡，3只造模不成）。

1.2.2 HE染色觀察心臟病理形態學變化

①切片，厚度約3μm。置于60℃電熱恒溫箱中烘烤過夜。②常規脫蠟水化組織切片。③蘇木素染色4～5min，自來水洗。④鹽酸酒精分化2s。⑤氨水反藍2s。⑥伊紅染色2min。⑦升濃度酒精脫水，二甲苯透明，用中性樹膠封片。

1.2.3 MASSON染色觀察心臟膠原含量

①切片，厚度約6μm。置于60℃電熱恒溫箱中烘烤過夜。②常規脫蠟水化組織切片。③蘇木素染色4～5min，自來水洗。④鹽酸酒精分化2s。⑤MASSON復合染色液5min，自來水洗。⑥5ā磷鎢酸5～10min，自來水洗2次。⑦亮綠染色液5min，自來水洗2次。⑧酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.3 統計學分析

采用 SPSS17.0 統計分析軟件進行單因素方差分析，數據用±s表示，組間比較采用 LSD 法，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠血糖、血脂變化

糖尿病心肌病組血糖、血脂明顯升高，小劑量治療組和大劑量治療組各指標明顯低于糖尿病心肌病組，且有統計學意義（P＜0.05）。大劑量治療組各指標下降更明顯，且有統計學意義（P＜0.05）。

2.2 各組大鼠心臟的形態學觀察結果

心肌HE染色：糖尿病心肌病組部分肌纖維肥大，部分肌纖維變細，肌漿濃縮。小劑量治療組和大劑量治療組有不同程度的改變，心肌排列較規整，心肌細胞橫紋較清晰，大劑量治療組改變更顯著。MASSON染色：糖尿病心肌病組心肌間質膠原纖維明顯增多，小劑量治療組和大劑量治療組有不同程度的減輕，大劑量治療組減輕更顯著。

2.3 各組大鼠心臟組織免疫組織化學染色結果

PPAR-α主要陽性表達部位為細胞核，ET-1主要陽性表達部位為細胞漿。小劑量治療組和大劑量治療組PPAR-α陽性表達率明顯高于糖尿病心肌病組，ET-1陽性表達率明顯低于糖尿病心肌病組（P＜0.05）。大劑量治療組與小劑量組相比，PPAR-α陽性表達率高，ET-1陽性表達率低（P＜0.05），見表1。

表1 各組大鼠心臟組織PPAR-α、ET-1表達陽性率比較(%，±s)

表1 各組大鼠心臟組織PPAR-α、ET-1表達陽性率比較(%，±s)

指標 糖尿病心肌病組(n=8)小劑量治療組(n=8)大劑量治療組(n=8)P值PPAR-α 6.50±2.67 22.50±2.78 46.13±4.42 ＜0.05 ET-1 66.63±5.66 45.75±5.50 15.75±4.00 ＜0.05

3 討 論

本實驗糖尿病心肌病組大鼠血糖、血脂等生化指標、心肌組織的病理變化以及心臟膠原含量的變化均符合糖尿病及DCM，表明STZ腹腔注射法造模成功。本實驗重點通過觀察糖尿病病心肌病大鼠治療前后心臟組織的膠原含量的變化以及PPAR-α、ET-1的蛋白表達水平，來探討GLP-1類似物治療糖尿病心肌病的可能作用機制。

糖尿病心肌病（DCM）是一種特異性心肌病，病理表現為心肌肥厚和心肌纖維化，是糖尿病患者的主要心臟并發癥之一[1,2]。近年來研究發現，心肌纖維化和心肌膠原間質沉積是DCM病變的一種重要特征。其中內皮素（ET）是導致心肌纖維化的一個重要因素。李瑞芳等證明了非諾貝特激活PPAR-α后可以通過調控轉錄因子NFATc4來抑制ET-1誘導的心肌肥大反應[3]。胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）是一種是由腸道內L細胞分泌的一種十分重要的腸促胰島素，其受體激動劑Exendin-4是由動物唾液分泌的GLP-1類似物[4,5]。近年來對GLP-1的研究發現其對心血管系統具有保護作用，如改善血管內皮功能，調節心率、血壓，改善心功能，改善心肌缺血等[6]。本實驗通過免疫組織化學法觀察了在GLP-1類似物的干預下糖尿病心肌病大鼠心臟PPAR-α，ET-1的表達情況，結果顯示：糖尿病心肌病組PPAR-α陽性表達率為（6.50±2.67）%，明顯低于大劑量治療組（46.13±4.42）%與小劑量組（22.50±2.78）%，ET-1陽性表達率（66.63±5.66）%明顯高于大劑量治療組（15.75±4.00）%與小劑量組（45.75±5.50）%（P＜0.05）。大劑量治療組與小劑量組相比PPAR-α陽性表達率高，ET-1陽性表達率低（P＜0.05）。可見，在DMC中，ET-1的表達與心肌纖維化具有相關性，促進了心肌纖維化；而PPAR-α的表達與ET-1的表達相反，即DMC中PPAR-α的表達減少。通過GLP-1類似物的干預，PPAR-α表達增加，ET-1表達減弱，且具有劑量依賴性。

本實驗通過給予GLP-1類似物對DCM大鼠進行治療來探討GLP-1類似物可能是通過劑量依賴性的激活PPAR-α受體，從而下調ET-1的表達，對DCM大鼠心肌纖維化起到一定的改善作用，從而延緩DCM的進展。目前GLP-1類似物對糖尿病心肌病的治療報道較少，其作用機制尚不清楚，還需結合臨床實驗深入研究，為治療心臟疾病開闊新的領域。

[1]黃婭茜,王憲,孔煒.糖尿病心肌發病機制的研究進展[J].生理科學進展,2010,41(1): 31-36.

[2]周彬,錢孝賢.糖尿病心肌病的研究進展[J].新醫學,2010,41(3):197-199.

[3]李瑞芳,段冷昕,樂康,等.PPAR-α激活對ET-1誘導的心肌肥大和轉錄因子NFATc4的影響[J].中國病理生理雜志,2009,25(6):1046-1050.

[4]Perry T,Greig NH.Enhancing central nervous system endogenous GLP-1 receptor pathways for intervention in Alzheimer′s disease[J].CurrA lzheim er Res,2005,2(3):377-385.

[5]Greig NH,Mattson MP,Perry T,et al.New therapeutic strategies and drug candidates for neurodegenerative diseases:p53 andTNF2{alpha} inhibitors,and GLP-1 recep tor agonists[J].Ann NY Acad Sci,2004,1035:290-315.

[6]Barragan JM,Rodrguez RE,Bzquez E.Changes in arterial bloodp ressure and heart rate induced by glu cagon-l ike pept ide-1-(7-36)amide in rats[J].Am J Physio,l 1994,266 (3 Pt 1):459-466.