治療骨質增生疼痛中藥酒的指紋圖譜研究

段梅莉* 石 慧 吳海波 李 卉 黃麗瑛 李建其*

（1 華東理工大學，上海 200237；2 上海醫藥工業研究院，上海 200437）

骨質增生引起的肩周炎等各種疼痛是中老年常見疑難病癥，尚無特效的西藥醫治，臨床常用的鎮痛藥有對乙酰氨基酚（撲熱息痛）、非甾體抗炎藥等緩解鎮痛病情的藥物[1]。雖有針灸、按摩牽引等療法，但存在復發率高的缺點[2,3]。由于中藥治療效果較好，近年來以中藥治療骨質增生疼痛漸成主流[4-6]。

本文中治療骨質增生疼痛的中藥方劑是以藥酒形式給藥[7]。該藥酒飲用量低（1～5mL/次），起效快，藥效高且持久。我們以藥酒為原料，濃縮后用溶劑萃取法分離其組成，對得到的各分離相進行鎮痛活性測試，并用HPLC、NMR圖譜對有較好活性的水相AD進行鑒定分析。并且將相同中藥方劑的水提藥液濃縮，測試用溶劑萃取法得到的水相WP，通過該方劑藥酒和水提藥液鎮痛活性的比較，分析評價了它們之間的區別。

1 實驗部分

1.1 實驗材料

將中藥紅花、紫草、草烏、川烏、烏蛇、烏梅及雙花按照一定配比用高度白酒浸制而成藥酒；按照相同中藥配方，用水煎煮而成水提藥液；AR級無水乙醚，石英砂，上海凌峰化學試劑有限公司；95%乙醇，上海振興化工一廠；CP級正丁醇，上海菲達工貿公司。

1.2 分析方法和儀器

美國Waters 2795高效液相色譜儀，HPLC色譜柱為Xterra-C18（2.1×150mm，5μm），流動相為0.05%TFA水溶液/0.05%TFA的乙腈溶液，樣品流速為0.2mL/min，柱溫30℃，檢測光波長247nm。德國BRUKER AVANCE 500超導傅立葉變換核磁共振波譜儀，NMR樣品制備以D2O為溶劑。鎮痛活性采用醋酸扭體法和熱板法進行測試。

2 實驗結果和討論

2.1 藥酒的濃縮分離

用白酒浸制的方劑藥液呈紫紅色透明狀液體。將500mL藥酒濃縮后得到6.0g的褐色黏稠膏狀物，加入200mL的蒸餾水攪拌，按由低到高的極性順序用有機溶劑乙醚、氯仿和正丁醇逐級進行萃取。各萃取相濃縮后的質量及其含量百分比見表1，可明顯看出水相AD是藥酒中含量最高的一個組分，占總量的70%～80%。

表1 藥酒的溶劑萃取相含量百分比

2.2 藥酒分離相的鎮痛活性評價

藥酒經溶劑萃取得到的乙醚相、氯仿相以及正丁醇相均難溶于水，采用灌胃給藥的方式進行試驗，水相采用皮下給藥的方式對小老鼠進行了鎮痛活性試驗，具體數據見表2、表3。結果顯示，氯仿相和正丁醇相均無鎮痛活性；乙醚相有鎮痛作用，但兼具致痛作用；藥酒中水相AD由表1可知是各萃取相中含量最多的組分，而且AD易溶于水，采用皮下給藥的方式對小老鼠進行的鎮痛活性試驗結果顯示，AD在所測劑量范圍和給藥方式下對扭體法和熱板法的實驗都有效，具有較好的鎮痛作用。因此，水相AD指紋圖譜的確定應是藥酒質量標準研究的重點。

表2 扭體法測定各萃取相鎮痛活性的結果

表3 熱板法測定各萃取相鎮痛活性的結果

2.3 藥酒水相AD的HPLC分析

HPLC指紋圖譜分析選用Xterra-C18色譜柱，適用于強極性物質的分離。為保證溶液的均一性，對每個樣品采取了兩次進針的原則，得到的HPLC譜圖見圖1。浸制1個月和3個月的藥酒中水相樣品進針后2～6min，10～12min，13～18min以及24min的出峰有4組，這些曲線基本保持一致，重復率高，穩定性好。這些結果表明，HPLC的測定方法可以作為治療骨質增生疼痛中藥方劑的藥酒質量評估指紋圖譜的分析。

圖1 藥酒水相AD（浸制1，3個月）的HPLC譜圖

2.4 藥酒水相AD的NMR分析

圖2 水相AD的1H-NMR譜圖

圖3 水相AD的13C-NMR譜圖

將AD經短的硅膠柱（流動相為95%的乙醇）過濾并濃縮后得到黃褐色黏稠狀的固形物。以D2O為溶劑制成褐色透明的NMR樣品，對AD的1H-NMR和13C-NMR譜圖分析分別如圖2和圖3所示。圖1中，主要吸收峰的化學位移多集中在3.2～3.8ppm（-CH2-OH、-CH2-OR）區域，還有少量位于1.1～1.4，1.8～2.2ppm區域的（烷基）吸收峰，幾乎未出現6～8ppm芳香烴類的特征峰。圖2中，吸收峰主要集中在60-80ppm（C-O、C-O-R）區域，還有7～8個中強峰位于80～150ppm區域。此外25～45ppm區域也有幾個弱的吸收峰，沒有出現180ppm以上的羰基、羧基等官能團的特征峰。因此可基本排除水相AD中具有芳烴骨架的黃酮類、醌類以及脂肪酸等化合物的大量存在，推測水相AD組分中主要含有一些多糖-寡糖類化合物。

2.5 水提藥液的濃縮分離及其鎮痛活性評價

將與藥酒同等量的中草藥用傳統方法煎煮后過濾，得到了褐色的水提藥液。將水提藥液濃縮后得到3.2g的黑褐色固形物。加入200mL的蒸餾水，按由低到高的極性順序用有機溶劑乙醚和正丁醇逐級進行萃取。各萃取相的質量及其含量百分比見表4，可以看出，水相WP仍然是水提藥液中含量最高的一個組分，占總量的80%～90%。

表4 水提藥液的溶劑萃取相含量百分比

水相WP的鎮痛活性測試，只對扭體法實驗有效，對熱板法無效。在所測劑量范圍和給藥方式下水相WP顯示了較弱的鎮痛活性，數據見表5。

表5 扭體法WP鎮痛活性的參數

3 小 結

治療骨質增生疼痛中藥方劑的藥酒，與方劑的水提藥液相比，前者濃縮物的重量大約是后者的兩倍。藥酒水相AD的質量也大約是水提藥液水相WP的2倍，而且水相AD的鎮痛活性明顯高于水相WP。結果說明治療骨質增生疼痛中藥方劑的藥酒，從鎮痛活性有效成分的含量和藥用效果來看，都明顯優于水提藥液。因此治療骨質增生疼痛中藥方劑的配制，應以高度白酒浸制為基準，不能以水替酒。

通過不同浸制時間藥酒水相AD的HPLC譜圖曲線對比，曲線基本保持一致，重復率高，穩定性好，表明用HPLC再輔以操作簡便的IR指紋圖譜分析可以成為治療骨質增生疼痛中藥方劑藥酒的質量檢測方法。

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