Caspase-3在小鼠毛囊周期中的表達及激活規律的研究

章旭日 雷明星 連小華*

（1 長沙市賀龍體育運動學校，湖南 長沙 400100；2 第三軍醫大學基礎醫學部細胞生物學教研室，重慶 400038）

程序性細胞死亡（programmed cell death，PCD）也稱細胞凋亡，在生物體維持內環境穩態、器官的生長發育、防御外在及內在傷害以及防止癌細胞的擴散等方面均起著非常重要的作用[1]。

毛囊作為表皮的附屬器官，在出生后顯示出周期性的活動特性[2]，包括生長期，退化期和靜止期[3]。凋亡在維持毛囊的周期性活動中發揮著重要的作用，在退化期初期，一系列的凋亡信號通路被激活，有關促進與抑制凋亡基因之間的平衡調控被打破，一些內源性或外源性的凋亡因子開始誘導凋亡信號通路激活，毛囊的凋亡迅速發生[4,5]。

在毛囊凋亡的各種信號通路中，caspase家族的各類分子相互級聯，在凋亡的發生中起著重要的作用。而Caspase-3處于凋亡有序級聯反應的下游，是依賴Caspase凋亡機制中起執行者核心作用的關鍵分子，是細胞凋亡發生的關鍵步驟及一切凋亡信號轉導的共同通路[6,7]，它的活化是凋亡進入不可逆階段標志。Caspase-3發揮活性需要通過剪切pro-Caspase-3形成活性形式的Active Caspase-3。Active Caspase-3的形成是判斷細胞凋亡是否執行的關鍵。

Caspase-3及其激活體廣泛的表達在毛囊的各類細胞中，但目前對于系統的研究毛囊一個周期的Caspase-3及其激活體Active Caspase-3的表達情況知之甚少。由于Caspase-3對于毛囊周期性維持的重要特性，我們通過免疫組織化學系統的研究發現，Caspase-3及其激活體表達于毛囊的各個時期，表現為生長期較弱，而退化期很強，靜止期較弱。而在毛囊一個周期中，Active Caspase-3在毛囊的各個時相點的表達量均低于Caspase-3的表達。我們的研究證明，Caspase-3及其激活體在毛囊中的表達具有高度的時空特異性，而毛囊的凋亡活動與Caspase-3及其激活體的表達呈正相關。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

Caspase-3抗體（santa craze公司），Active Caspase-3抗體（北京博奧森生物科技有限公司），免疫組織化學試劑盒（北京中衫生物技術公司），DAB顯色試劑盒（北京中衫生物技術公司）。石蠟切片機（德國Leica公司）。

1.2 實驗動物

取出生后11d，16d，18d，24d的C57BL/6小鼠各5只，體質量分別為130～150、150～170、170～200、200～250g。

1.3 實驗方法

1.3.1 取材

取各鼠齡小鼠背皮4%多聚甲醛固定過夜，常規梯度酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟包埋。

1.3.2 免疫組織化學

5um石蠟切片二甲苯透明，梯度酒精水合，3%H2O2室溫封閉15min，去除內源性過氧化物酶活性。檸檬酸微波抗原修復。滴加一抗，4℃孵育過夜。PBS洗，滴加二抗37℃孵育30 min，PBS洗，DAB顯色。

2 結 果

2.1 免疫組織化學檢測Caspase-3在B6小鼠毛囊周期中的表達

在小鼠出生后的11d（圖1A，A’），Caspase-3主要表達與毛囊的毛球部和毛球部的上段的內外根鞘細胞中，而在小鼠毛囊處于退化期的16d（圖1B，B’）和18d（圖1C，C’），Caspase-3呈現強烈的核表達于毛囊的各類細胞中，特別是在內外根鞘中的表達量要明顯高于在生長期的水平；當小鼠毛囊進入了靜止期（圖1D，D’），Caspase-3依然表達于毛干的外圍。而毛囊的毛乳頭細胞在各個時期都很少有Caspase-3的表達。

2.2 免疫組織化學檢測Caspsae-3激活體Active Caspase-3在小鼠毛囊周期中的表達

在小鼠毛囊各時期中，激活體呈明顯的核表達于毛囊的各類細胞中。在B6小鼠出生后的11d，激活體在B6小鼠主要表達在毛囊的毛母質，內外根鞘幾乎沒有表達；在B6小鼠出生后的16d（圖1B，B’），毛囊剛進入退化期，激活體在小鼠毛囊的毛球中表達強烈，而在內外根鞘也有部分細胞開始表達；在小鼠出生后的18d，毛囊正值退化期，激活體非常明顯的表達于毛囊的毛母質，而在內外根鞘的表達非常強烈，遠高于生長期和退化期初期的水平。在靜止期，激活體少量的表達于毛干的外圍部位，且表達量處于各時期中最低水平。同樣，毛囊的毛乳頭細胞很少有激活體陽性表達。

3 討 論

圖1 免疫組織化學檢測C57BL/6 鼠各個時期毛囊中Caspase-3表達

圖2 免疫組織化學檢測C57BL/6 鼠各個時期毛囊中Active Caspase-3表達

毛囊周期性的維持需要凋亡因子的參與，Caspase-3作為凋亡的關鍵分子，在毛囊發生凋亡時必不可少。研究顯示Caspase-3廣泛的表達于毛囊的各個部位中，并在要執行凋亡的時候實現激活，形成激活體Active Caspase-3。而以往對于Caspase-3在毛囊中作用往往是作為一個凋亡的指標而限制在某一個時相點，并沒有進行系統的研究。我們對C57BL/6這種最常規的小鼠為模型，用免疫組織化學的方法檢測了Caspase-3及Active Caspase-3在小鼠出生后毛囊生長期，退化期和靜止期的表達及激活情況。首先，在表達部位上，我們的研究與以往的研究并無不同。在毛囊中，Caspase-3及激活體均呈明顯的核表達于毛囊各類細胞中。在小鼠出生后毛囊處于生長期中后期，Caspase-3主要表達在毛囊的毛母質以及毛球部上段的內外根鞘細胞中，而其激活體主要表達在毛母質的細胞，在內外根鞘細胞中表達很少，這說明了雖然內外根鞘細胞有Caspase-3的表達，但沒有被激活，所以其在生長期中后期并不會有大量的凋亡發生。在小鼠出生后16d，毛囊處于退化期的初期，Caspase-3及其激活體在毛母質和內外根鞘都有表達，而且要比生長期高。總體來說，Active Caspase-3在毛囊各個部位的表達都要低于Caspase-3的表達，說明在退化期初期，毛囊已經開始發生凋亡，但是凋亡并不是特別的明顯。而在小鼠出生后的18d，毛囊處于退化期的中后期，Caspase-3及其激活體除了在毛母質表達增強，在內外根鞘的表達明顯要比退化期早期高，這表明Caspase-3在退化期中期大量被激活，從而內外根鞘發生凋亡，也進一步證實了在退化期，毛囊的毛球部萎縮，內外根鞘縮短是跟Caspase-3的大量表達及激活是相關的。而在靜止期，兩者的表達都低于生長期和退化期，但Caspase-3與其激活體的表達有著很大的區別，Caspase-3表達在毛干的外圍，包括干細胞所在的bulge區，而其激活體Active Caspase-3在這些部位的表達并不明顯，說明Caspase-3并沒有被激活。毛囊的靜止期是一個相對靜止的時期，其增殖和凋亡活動均不明顯，通過Caspase-3及其激活體的表達分析正好證實了這一現象。

而在整個毛囊的周期中，Caspase-3及其激活體很少或者并沒有在毛乳頭細胞中表達，這表明毛乳頭細胞在形成之后，其凋亡的進程并不會隨著毛囊的周期而進行。所以，到了靜止期，毛囊的細胞幾乎已經凋亡完全，毛乳頭的細胞還能夠保留。與毛囊的其他結構不同，毛乳頭細胞是真皮來源的細胞，有研究表明，毛乳頭細胞是毛囊的信號源，所以，毛囊凋亡的信號源也很有可能是來自毛乳頭細胞，而其自身的凋亡規律與毛囊的上皮型細胞并不相同，我們通過Caspase-3及其激活體在毛囊中的表達來看，也正好符合這個觀點。

因此，認為Caspase-3的表達具有高度的時空特異性，其表達與激活誘導毛囊細胞的凋亡，調節毛囊的內環境穩態和周期性活動。但是，毛乳頭的凋亡并不與毛囊的上皮型細胞的凋亡規律相同，毛乳頭如何調節上皮型細胞的凋亡，及其自身的凋亡規律有待進一步深入的研究。

本研究從毛囊的一個周期中從生長期到靜止期四個時相點Caspase-3表達及其激活體的表達變化規律，系統闡明了Caspase-3及其激活對于毛囊維持其內環境穩態以及周期特性的重要性，為研究毛囊凋亡及周期性活動提供了良好的基礎。

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