通脈抗栓顆粒質量標準研究

張 潔 白 娟 李成網*

（安徽省醫學科學研究院，安徽 合肥 230061）

通脈抗栓顆粒是根據臨床經驗方開發的六類中藥新藥，已獲國家藥品食品監督管理局頒發的臨床批件（批件號：2007L05140），由當歸、川芎、葛根、人參葉等中藥組成，具有益氣養陰，活血通脈等功效。用于腦血栓癥見頭暈目眩，頭痛，肢體麻木或強急，氣短乏力，便干便秘，口干口渴，舌質紅或質暗淡等氣陰兩虛, 瘀阻腦絡證。采用薄層色譜法對其中的當歸、川芎、麥冬、人參葉進行定性鑒別，采用HPLC法對葛根中的有效成分葛根素進行含量測定，可有效控制通脈抗栓顆粒的質量。

1 儀器、試藥與樣品

Waters 600型高效液相色譜儀（美國Waters公司）；UV 996型紫外檢測器；AD-2型百萬分之一電子天平（美國PE公司）；BP210S型萬分之一電子天平（德國賽多利斯）；AS3120型超聲清洗器（天津奧特賽恩斯）；葛根素為對照品（批號0752-9806供含量測定用）；人參皂苷Rb1對照品（批號704—8903）；人參皂苷Re對照品（批號754-9002）；人參皂苷Rg1對照品（批號0703-200119）；當歸對照藥材（批號120927-200310）；川芎對照藥材（批號120918-200306）；麥冬對照藥材（批號121013-200607）均購于中國藥品生物制品檢定所。甲醇、磷酸為色譜純，水為重蒸水，其他試劑均為化學純。通脈抗栓顆粒由安徽省華康醫藥科技開發有限責任公司提供（規格：每袋裝8g）。

2 方法與結果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 當歸川芎的鑒別[1]

取本品15g，研細，加乙醚150ml浸漬1h后，超聲處理5min，濾過，濾液揮干，殘渣加醋酸乙酯0.5mL使溶解，作為供試品溶液。另取當歸對照藥材和川芎對照藥材各1g，分別加乙醚50mL，浸泡1h，超聲處理5min，濾過，濾液揮干，殘渣加醋酸乙酯2mL使溶解，分別作為對照藥材溶液。照薄層色譜法試驗，分別吸取當歸和川芎對照藥材溶液3μL，供試品溶液10μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以正已烷-醋酸乙酯（9∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯兩個相同顏色的熒光斑點。陰性對照無干擾。見圖1。

圖1 當歸川芎鑒別薄層色譜圖

2.1.2 麥冬的鑒別[2]

取鑒別（1）項下乙醚提取后的藥渣，加乙醇100mL回流1h，濾過，濾液回收乙醇至干，加3%硫酸溶液10mL置沸水浴加熱回流2h，用3%氫氧化鈉溶液調pH至中性，水浴蒸干，殘渣加氯仿2mL使溶解，作為供試品溶液，另取麥冬對照藥材2g，加乙醇20mL回流1h，同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法試驗，吸取對照藥材溶液10μL和供試品溶液10μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-醋酸乙酯（1∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸溶液，于105°C加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。陰性對照無干擾。見圖2。

2.1.3 人參葉的鑒別[3,4]

圖2 麥冬鑒別薄層色譜圖

取本品5g，研細，加甲醇50mL，超聲處理20min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水25mL使溶解，濾過，濾液加水飽和正丁醇提取3次，每次25mL，合并正丁醇提取液，用正丁醇飽和的氨試液洗3次，每次25mL，棄去氨試液，正丁醇液水浴蒸干，殘渣加甲醇2mL使溶解，作為供試品溶液。另取人參皂苷Rb1、Re、Rg1對照品，分別加甲醇制成每1mL各含0.5mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液5～10μL，對照品溶液3～5μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-醋酸乙酯-水（4∶1∶5）的上層液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至色斑清晰，供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。陰性對照無干擾。見圖3。

圖3 人參葉鑒別薄層色譜圖

2.2 葛根素的含量測定

葛根為方中君藥，其主要成分為葛根素。用高效液相色譜法測定中藥制劑中葛根素的含量的報道很多[5,6]。在參考文獻的基礎上，為了有效地控制本品的質量，建立了本品的葛根素的高效液相色譜法的測定法，經方法學考察，本法簡便、準確、可靠、重現性好，可有效控制本品質量，其方法學考察如下：

2.2.1 色譜條件與系統適用性試驗

2.2.1.1 對照品溶液的制備

精密稱取葛根素對照品適量，加30%乙醇制成每1mL含60μg的溶液，即得。

2.2.1.2 供試品溶液的制備

取本品，研細（過4號篩），取0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入30%乙醇50mL，密塞，稱定重量，超聲處理30min，放冷，再稱定重量，用30%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.2.1.3 陰性對照溶液的制備

取缺葛根的陰性制劑，按供試品溶液制備項下的方法依法制備陰性對照溶液。

2.2.1.4 色譜條件的選擇

色譜柱：Shim-Pack CLC ODS柱（150×4.6mm，5μm）；流動相：甲醇-0.1%磷酸溶液（24∶76）；檢測波長：250nm；柱溫：30℃；流速：1.0mL/min。在此條件下，葛根素與其它成分均能很好地分離，供試品中葛根素保留時間與對照品一致，且陰性對照無干擾，結果見圖4。

圖4 對照品、樣品、陰性樣品HPLC色譜圖

2.2.5 線性關系考察

精密吸取葛根素對照品溶液（0.21744mg/mL）1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL分別置10mL量瓶中，加30%乙醇稀釋至刻度，搖勻。分別精密吸取20μL，依次注入液相色譜儀中，按上述色譜條件測定，峰面積分別為：1516068、2931786、4409670、5889355、7336747。以葛根素的濃度為橫坐標，相應的峰面積積分值為縱坐標，計算，得線性回歸方程為：A=67140C+37047 r=0.99997（n=5）。表明葛根素在21.744～108.72μg/mL范圍內呈良好的線性關系。

2.2.6 供試品精密度試驗

取按供試品溶液制備法制備的供試液（批號040805），按上述色譜條件注入液相色譜儀，連續進樣5次，記錄葛根素峰面積分別為:5179674、5275425、 5276877、5392464、5317029，RSD=1.46%，表明精密度良好。

2.2.7 穩定性試驗

將按供試品溶液制備法制備的供試液（批號040805）于0、1、2、4、6、8h按上述色譜條件重復測定一次，記錄葛根素峰面積分別為:5463520、5417945、5489535、5464131、5471071、5561982，RSD=0.87%。表明供試液在8h內穩定。

2.2.8 重復性試驗

取同一批號樣品（批號040805）共5份，按供試品溶液制備法制備供試液，精密量取該溶液和對照品溶液各20mL，按上述色譜條件注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計算葛根素含量分別為65.5728mg/袋，65.7864mg/袋，64.1368mg/袋，65.0384mg/袋，64.9488mg/袋，RSD=0.98%。表明方法重復性良好。

2.2.9 回收率試驗

精密量取已知含量（65.0968mg/袋）的樣品適量，分別精密加入葛根素對照品適量，按正文含量測定項下的方法依法制備供試品溶液并測定，結果見表1。

表1 回收率試驗結果（n=6）

2.2.10 樣品測定

對3批中試樣品按供試品溶液制備方法制備樣品溶液，分別精密吸取樣品溶液和對照品溶液各20mL，注入液相色譜儀，按外標法以峰面積計算含量，結果見表2。

表2 樣品含量測定結果

3 討 論

3.1 本方為中藥復方制劑，采用薄層色譜鑒別方法對方中的每一味中藥均進行了鑒別，并進行了陰性對照試驗，結果其方法簡便且專屬性強，可有效控制本品的質量。

3.2 關于葛根中葛根素的含量測定方法，文獻報道很多，但在本制劑中未見報道，對流動相進行了選擇，先后比較了甲醇-水（25∶75）、甲醇-水（22∶78）、甲醇-0.1%磷酸溶液（22∶78）、甲醇-0.1%磷酸溶液（24∶76）。結果以甲醇-0.1%磷酸溶液（24∶76）為流動相最佳。

3.3 對供試品溶液制備的超聲提取時間也做了考察，分別比較了超聲處理10、20、30、40min的效果。結果表明，超聲提取30min已能提取完全，因此超聲提取時間選擇30min為佳。

[1]中華人民共和國衛生部藥典委員會編.中華人民共和國藥典[S].2000年版一部.北京:化學工業出版社,2000:433.

[2]余伯陽.不同麥冬假葉樹皂甙元的含量比較[J].中國藥科大學學報,1987,18(2):117.

[3]中華人民共和國衛生部藥典委員會編.中華人民共和國藥典[S].2000年版一部.北京:化學工業出版社,2000:6.

[4]苗明三,李振國.現代實用中藥質量控制技術[M].北京:人民衛生出版社,2000:36.

[5]楊小平.RP-HPLC法測定感冒清熱顆粒中葛根素的含量[J].藥物分析雜志 2001,21(5):331.

[6]劉建峰.HPLC法測定舒心片中葛根素含量[J].西北藥學雜志,2000,15(5):1990.