有機-無機雜化整體柱的制備及對尿液中倍他米松的富集分析

賈艷花 劉海燕 楊 寧 楊更亮

（河北大學藥學院，河北省藥物質量重點實驗室，河北 保定 071002）

整體柱材料研究在過去的二十幾年中取得了很大的進展，它主要分為有機聚合物整體柱[1-4]和硅膠整體柱[5-7]兩大類，有機聚合物整體柱在一定的pH范圍內具有良好的生物相容性，但在有機溶劑中具有溶脹作用易導致結構的變化；硅膠整體柱雖然具有一定的機械強度，但是在一定的酸性條件和輕微的堿性條件下Si-O-C鍵容易水解，且在干燥或熱處理過程中柱床易收縮和斷裂，限制了其應用，能夠兼顧二者優點，避其不足[8]。本文用γ-氨基丙基三乙氧基硅烷、四乙氧基硅烷、環氧樹脂三種反應物質，采用兩步催化溶膠-凝膠法制備了含有長鏈有機結構雙苯基雜化液相用整體柱，以該整體柱作為固相萃取柱，對尿樣中的倍他米松進行了富集分析

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

主要儀器：P3000高效液相色譜儀（中國，北京創新通恒科技有限公司）； UV-3000紫外/可見分光檢測器（中國，北京創新通恒科技有限公司）；色譜工作站CXTH-3000（北京創新通恒科技有限公司）；ODS C18柱（依利特，150mm × 4.6mm i.d.，5μm）；不銹鋼空色譜柱管（10mm× 4.6mm i.d.）；SZ-97自動三重純水蒸餾器（上海亞榮生化儀器廠）；HH-601 超級恒溫水浴（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）。

四乙氧基硅烷（ TEOS 杭州硅寶化工有限公司）；γ-氨丙基三乙氧基硅烷（HG-550 杭州硅寶化工有限公司）；環氧樹脂（藍星新材料無錫樹脂廠）；泊洛沙姆（PF127天津一方科技有限公司）；乙醇（天津市進豐化工有限公司）；鹽酸（天津永飛化工廠）；三乙胺（天津市福晨化學試劑有限公司）；甲醇（天津市科密歐化學試劑有限公司）；尿液由健康志愿者提供。

1.2 有機-無機雜化整體柱的制備

環氧樹脂1.5g，HG-550 2mL加入5 mL的塑料離心管中，超聲后混合均勻，通入氮氣10min，將離心管密封，在25℃水浴中反應3h。泊洛沙姆（PF127）0.0010 g、鹽酸 （0.2 mol/L）150μL、甲醇250μL、環氧樹脂和HG-550反應后混合溶液190μL、四乙氧基硅烷240μL嚴格按照順序加入到10mL的塑料離心管中，超聲混合均勻后轉移到不銹鋼管中，密封，在60℃水浴4h，取出不銹鋼管在線加入三乙胺適量，密封，在60℃水浴12h。分別用甲醇和水將未反應的物質沖出，即得新型有機-無機雜化整體柱。

1.3 樣品的制備

精密稱取適量的倍他米松標準品制備成為1.0g/L的標準儲備液。將標準的儲備液稀釋成為0.01g/L中間儲備液，用于配制5～30mg/L尿液樣品（放于冰箱中保存）。

1.4 色譜條件

富集條件：整體柱（自制，10 mm ×4.6 mm）：流動相：水、流速1.0mL/min，檢測波長280nm。分離的條件：C18柱（依利特，150mm × 4.6mm i.d.，5 μm）；流動相：甲醇-水（60∶40，v/v）；流速：1.0mL/min，檢測波長254nm。

1.5 樣品處理與色譜分析

將自制整體柱連接在液相上，按照1.4富集條件，進樣品5μL，待樣品走完，尿樣基本沖洗干凈后停泵，在整體柱的末端連接上C18柱，按照1.4分析條件進行分析，分離整體柱上富集的倍他米松。

2 結果與討論

2.1 流速和壓力曲線

以甲醇為流動相，測定整體柱的柱背壓，考察了整體柱柱背壓和流動相流速之間的關系。該整體柱柱背壓較低，具有良好的通透性，柱背壓和流速呈良好的線性關系（r=0.99925）。

2.2 整體柱材料的表征

圖1是整體柱的電鏡掃描圖，從圖中可以看出整體柱具有大小不等的孔通道的網絡骨架結構，整體柱具有良好的通透性。

圖1 SEM image of the cross sectional view of the monolithic column

2.3 整體柱的預處理能力

以水為流動相將5μg/mL的倍他米松標準溶液在254nm下分別進樣于空柱管和整體柱，結果見圖2。然后分別將5μL的尿樣和5μL含有倍他米松的尿樣分別按照1.5進行進樣，所得的分離圖圖3。

圖2 the solution of Betamethasone injected into the empty tube (a)and monolithic column(b)

圖3 Chromatograms obtained from blank urine （a）and urine spiked with Betamethasone (b)

圖2可以看以水為流動相時，在整體柱上進樣時無色譜峰，說明倍他米松能很好的富集在整體柱上。從圖3中可以倍他米松在9.2min出峰，尿樣中無雜峰干擾測定，所以本實驗制備的整體柱能夠在富集倍他米松的同時除去尿液中的其它成分，可以作為檢測尿中倍他米松的預處理柱。

2.4 方法驗證性實驗

2.4.1 標準曲線

精密量取倍他米松標準溶液，用尿液稀釋成為質量濃度為5mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L、25mg/L、30mg/L系列的濃度梯度，按照1.5節的操作，每個濃度進樣品3次。用所得色譜峰面積A對尿藥濃度C（μg/mL）作標準曲線圖，回歸方程為標準曲線A=-1.61×104+1.89×104C，R=0.9994（n=6），在5～30mg/L范圍內具有良倍他米松好的線性。當儀器的信噪比為3時，測得倍他米松的檢測限6μg/L。

2.5.2 精密度與回收率

見表1。

表1 Precision accuracy and recovery of Betamethasone in urine sample

準確配制倍他米松5mg/L、15mg/L、30 mg/L 三種濃度尿液樣品和同濃度的對照液各五份，尿液樣品按照1.5節的過程進樣分析，對照液直接進C18柱分析，實驗結果如上表，絕對回收率79.44%～ 83.03%之間，日內、日間精密度均＜5.0%，精密度，準確度良好，能滿足分析的要求。

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