不同運動時間對2型糖尿病大鼠骨骼肌Glut－4含量變化的研究

薛偉善

(遼寧師范大學體育學院，遼寧大連 116029)

不同運動時間對2型糖尿病大鼠骨骼肌Glut－4含量變化的研究

薛偉善

(遼寧師范大學體育學院，遼寧大連 116029)

為了解運動強度相同而運動時間不同對鼠肌葡萄糖載體－4(Glut－4)蛋白表達及含量的影響，采用制備糖尿病大鼠模型方法將SD大鼠分為正常對照組、糖尿病對照組、糖尿病運動組(20min組、40min組、60min組和80min組)等6組，以20m/min的強度進行8周的跑臺運動，用Western blot免疫印跡法檢測運動后GLUT－4蛋白含量。結(jié)果表明，與糖尿病對照組相比，運動時間20min、40min組、60min組和80min組的股四頭肌Glut－4蛋白含量顯著升高(P＜0.01);與20min組相比，運動時間40min組、60min組及80min組的Glut－4蛋白含量顯著升高(P＜0.01)，認為運動時間對Glut－4蛋白含量產(chǎn)生明顯的影響，運動時間達40min以上可能具有更好的效果。

不同運動時間;2型糖尿病大鼠;Glut－4含量

－4(Glut－4)蛋白含量降低和活動異常是主要原因［1］。以往的研究發(fā)現(xiàn)運動可提高骨骼肌細胞膜Glut－4蛋白的含量［2－3］，有助于Glut－4在骨骼肌細胞細胞膜上的易位，加快葡萄糖進入細胞內(nèi)的速度。以往的研究雖然觀察了運動對

Glut－4含量的影響，但這些研究均沒有深入研究不同時間運動的影響。運動時間在運動處方構(gòu)成的諸要素中尤為重要，機體對不同的運動時間產(chǎn)生不同的應答。糖尿病患者在進行康復鍛煉時，有關Glut－4蛋白的表達及含量隨不同運動時間的變化而改變的規(guī)律還不很清楚，系統(tǒng)的研究更少見。由于不清楚不同時間的運動對Glut－4蛋白的影響，因此在實踐指導時就缺乏科學的理論依據(jù)，使2型糖尿病患者在進行運動康復鍛煉時就具有一定的盲目性。因而開展此領域的研究，則具有重要的理論和實際意義。

1 材料與方法

1.1 材料

選用70只健康SD(Sprague－Dawley)大鼠(不分雌雄，體質(zhì)量為200g±14g)，SD大鼠由大連醫(yī)科大學動物飼養(yǎng)中心提供。在標準環(huán)境下分籠喂養(yǎng)，自由攝取水和食物，在喂養(yǎng)1周后進行適應性運動訓練。實驗分組為正常對照組(NC)10只，實驗組60只，均隨機選取。

1.1.1 制備2型糖尿病模型 2型糖尿病大鼠模型的制備參照洪麗莉等的實驗［4］。方法是喂食4周的自備高糖高脂飼料，并在飲水中添加濃度3%的果糖。同時按30mg/kg體重的劑量一次性腹腔內(nèi)注射 STZ的混合制劑:pH4.4，0.1mmol/L檸檬酸緩沖液。在注射1周后，測試大鼠葡萄糖耐量。具體方法是大鼠禁食4～6小時，腹腔注射葡萄糖(按2g/kg體重的標準)，斷尾采血，分別測定0、60和120min血糖的動態(tài)變化，糖尿病的診斷標準為:空腹血糖連續(xù)2次高于等于 7.8mmol/L、或葡萄糖負荷后 2h血糖高于等于11.1mmol/L［5］。本實驗造模的成功率可達85%。將符合標準的50只大鼠隨機分為糖尿病對照組、20min、40mi、60min及80min運動組，并繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)。2周后(大鼠禁食12h后)斷尾取血測空腹血糖及胰島素值。高糖高脂飼料配方:100kg飼料中添加人全蛋粉6kg、蔗糖23kg、煉豬油26.5kg，混和成形，其總熱量為20.103J/g，其中蛋白質(zhì)占15%，碳水化合物占50%，脂肪占25%。

1.1.2 制定運動模型 參照Soya等的實驗［6］，本實驗選20m/min強度的運動為負荷標準，進行時間為8周，方式為跑臺運動，實驗組分為:20min組、40min組、60min組和80min組。對照組大鼠常規(guī)喂養(yǎng)。本實驗過程中對動物的處置，符合有關的國際動物倫理學標準。本實驗由R＆D Systems公司提供GLUT－4多克隆抗體、由英國Amersham公司提供ECL、New England BioLabs預染蛋白Marker、國強生公司提供快速血糖儀及試紙。胰島素的測定采用放射免疫法，由南京生物工程研究所提供試劑盒。由北京福瑞生物工程公司提供甘油三酯和總膽固醇試劑盒。由北京碩林苑科技有限公司提供動物跑臺，大鼠跑臺型號為SLY－RTML。

1.2 實驗方法

1.2.1 收集標本 8周后，最后一次運動24h后，按50mg/ kg的標準腹腔注射3%戊巴比妥鈉進行麻醉，提取后肢股四頭肌肉組織并置于液氮中冷凍。

1.2.2 制備股四頭肌肌細胞膜 肌膜的制備參照Huisman等人的實驗［7］。取100g股四頭肌肌肉組織，冰上剪碎并加入裂解液［Tris－HCL20mol·L－1(pH7.5)，蔗糖330mol· L－1，EDTA 0.5mol·L－1，PMSF 1mol·L－1，Lepetin25mg· L－1］。離心機上1000r·min－1的標準離心10min。取上清液并以40000r·min－1的標準冷凍超速離心1h并棄上清。在所得沉淀中，再次加入裂解液，用超聲裂解的方法循環(huán)7次萃取，再以40000r·min－1的標準冷凍高速離心1h所得上清即是細胞膜組織。蛋白濃度的測定采用改良 Lowry法［8］。GLUT－4蛋白含量的測定采用Western blot免疫印跡法，取股四頭肌肌細胞膜樣品50μg先進行SDS－PAGE蛋白分離，然后將蛋白電轉(zhuǎn)移至NC(硝酸纖維素)膜上，再用奶粉(5%脫脂)TBS封閉，控制溫度4°C并過夜。室溫加抗Glut－4單克隆抗體1h，洗膜后，加辣根過氧化物酶標記的二抗1h，與ECL反應1min后即刻與X光片曝光并洗片，用圖像分析儀掃描(德國產(chǎn)Leica Q550－IW)，計算光密度并進行定量分析。以正常對照組的Glut－4蛋白含量為100計算其他各組的相對含量。

1.2.3 數(shù)理統(tǒng)計法 對所得實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析。顯著性水平為0.05。統(tǒng)計軟件采用SPSS 15.0。

2 實驗結(jié)果

與對照組相比，在糖尿病建模后，反應2型糖尿病特征的指標如體重、血清甘油三酯、總膽固醇、血糖和胰島素水平明顯升高(P＜0.01)。

表1 造模成功后兩組體重、血糖、血脂和胰島素水平的變化

對照組大鼠比，糖尿病對照組肌膜Glut－4蛋白含量明顯下降(P＜0.01)。與糖尿病對照組大鼠比，20min、40mmin、60min和80min組股四頭肌Glut－4蛋白含量顯著升高(P＜0.01)。與20min組相比，運動時間40min、60min及80min組GLUT－4蛋白含量顯著升高(P＜0.01)。運動時間達40min后，隨著運動時間的增加，Glut－4的含量不再隨著運動時間的增加而增加。

表2 不同運動時間對GLUT－4蛋白含量及磷酸化的影響

3 分析與討論

葡萄糖的跨膜轉(zhuǎn)運是以易化擴散方式實現(xiàn)的、并由位于細胞膜上的葡萄糖載體介導的。目前已發(fā)現(xiàn)有6種葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白，它們分別被命名為葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1－5，以及葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白7［9］。Glut－4是一種由509個氨基酸組成的糖蛋白，(分子量約48000)。在靜息狀態(tài)下絕大部分Glut－4位于細胞內(nèi)的各種細胞器上［10］，主要分布在微粒體、高爾基體和肌絲網(wǎng)等重要細胞器的膜上［11］。也有學者認為在細胞內(nèi)，存在對胰島素敏感的、富含Glut－4的特異性囊泡樣膜結(jié)構(gòu)。在葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白基因家族中Glut－4蛋白主要分布在肌肉和脂肪組織中其中小部分Glut－4位于細胞膜上。目前研究認為，運動和胰島素是刺激骨骼肌Glut－4轉(zhuǎn)位和轉(zhuǎn)運葡萄糖的兩個最重要因素。目前對這兩個因素對Glut－4的轉(zhuǎn)位是否具有同樣的效力，學術(shù)界仍存在很大的爭議和分歧。但是，幾乎所有的實驗都已證實，運動和胰島素是通過不同的信號途徑誘發(fā)GLUT－4發(fā)揮轉(zhuǎn)運葡萄糖作用的，其中胰島素是主要通過PI3K(磷脂酰肌醇－3－激酶)途徑，而運動認為主要與AMPK(激活絲裂原活化蛋白激酶)的活動有關。

依據(jù)Soya的大鼠跑臺實驗，20m/min相當于LT(Lactate Threshold)強度運動，15m/min為低于LT強度(Sub－LT)的運動，而25m/min和30m/min為高于LT強度(Supra－LT)的運動。LT為代謝的轉(zhuǎn)折點，是有氧代謝向無氧代謝轉(zhuǎn)換的臨界點，其運動強度相當血乳酸濃度4mmol/L，當運動強度高與LT時機體的代謝方式開始轉(zhuǎn)向無氧。本實驗結(jié)果顯示，經(jīng)過8周不同運動時間的運動，運動組血糖和胰島素均產(chǎn)生良好的改變，與其他學者的實驗結(jié)果相同［12］。本研究顯示，經(jīng)過8周運動后，骨骼肌Glut－4含量均有顯著增加，但當運動時間達到40min以上后與20min組相比，效果最好。以前的實驗顯示運動能更多地促進GLUT－4 mRNA的表達［13］，Dela等的實驗也發(fā)現(xiàn)，運動能明顯提高Glut－4含量［14］。本研究也顯示，運動時間可對Glut－4的含量產(chǎn)生顯著影響，隨著運動時間的延長，Glut－4的含量逐漸增加，但當運動時間達到40min以上后，Glut－4的含量達到峰值，不再隨運動時間的增加而增加。提示，在2型糖尿病的康復鍛煉中，運動時間要有個時域，為了更好地促進血糖的有效利用和提高機體的糖代謝水平，在適當?shù)卮_定運動強度的基礎上，將運動時間控制在40min以上可能對2型糖尿病患者的康復更加有利。

綜上，2型糖尿病動物模型進行20m/min強度運動時，在不同運動時間影響下，骨骼肌Glut－4含量均增加，但運動時間達到40min后，Glut－4含量增加的效果更好。

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Effects of Different Times’Exercise on Glut-4 Content in Skeletal Muscle of Type 2 DM Rats

XUE Weishan
(Physical Education Institute of Liaoning Normal University，Dalian 116029，Liaoning，China)

Objective:To explore the effects of different times’exercise on GLUT-4 protein content in type 2 DM rats．Method:Sixty SD rats were divided into six groups:normal control group(NC)、diabetes mellitus group(DMC)and 20min、40min、60min and 80min exercise group．The exercise groups did exercise for 8 weeks．The contents of GLUT-4 protein were measured by Western bolt analysis．Result:The contents of IRS-2 protein in 20min，40min，60m/min and 80min group enhanced(P＜0．01)respectively compare with the DMC group，and 40min，60min and 80min group enhanced (P＜0．01)compare with 20min group．Conclusion:The results showed that the exercise times have affected the contents of GLUT-4 protein，exercise times over 40min may have the better effect．

different times’exercise;type 2 diabetic rat;GLUT-4content 2型糖尿病明顯的特征是血液葡萄糖升高，但外周組織細胞攝取葡萄糖卻存在障礙，研究證實細胞膜上葡萄糖載體

G805.52

A

1004－0560(2012)04－0083－03

2012-05-06;

2012-06-15

國家自然科學基金項目(30970348)。

薛偉善(1958－)，男，副教授，主要研究方向為體育教學與運動健康促進。

責任編輯:喬艷春

?運動人體科學