不同生境及地區哈蟆油藥材中氨基酸成分比較分析△

王殿波，陳斌，單舒筠，李峰

（遼寧中醫藥大學藥學院，遼寧 大連 116600）

中藥科技

不同生境及地區哈蟆油藥材中氨基酸成分比較分析△

王殿波，陳斌，單舒筠，李峰*

（遼寧中醫藥大學藥學院，遼寧 大連 116600）

目的：比較不同生境及地區的哈蟆油藥材中氨基酸的含量，為評價該藥材質量提供依據。方法：6 mol·L－1鹽酸110℃水解24 h，加衍生化試劑2，4-二硝基氟苯，于60℃水浴中衍生1 h，P230II依利特氨基酸自動分析儀測定。結果：同一地區林下產的哈蟆油藥材中氨基酸含量，普遍高于稻田產的；相同生境中，林下產哈蟆油藥材以吉林產的氨基酸最高；稻田產哈蟆油藥材以遼寧產的最高。結論：以哈蟆油藥材中氨基酸的含量對其藥材質量進行評價，具有一定的實際意義。

哈蟆油；氨基酸；不同生境及地區；含量比較

哈蟆油RANAE OVIDUCTUS為蛙科動物中國林蛙Rana temporaria chensinensisDavid雌蛙的輸卵管。性平，味甘、咸；歸肺、腎經。具補腎益精，養陰潤肺功效。用于病后體弱，神疲乏力，心悸失眠，盜汗，癆嗽咳血［1］。首載于 《藥材資料匯編》［2］。目前哈蟆油商品藥材主要為東北地區林下和稻田兩種生境中的人工養殖的。本實驗收集東北地區兩種生境下的26份哈蟆油商品藥材，對其中具有補益作用的氨基酸成分的種類與含量進行測定及比較分析，以期為哈蟆油藥材質量評價提供實驗依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

P230II依利特氨基酸自動分析儀；UV230II紫外檢測器（大連依利特公司）；AS5150A超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；PHS-25型pH計（上海盛磁儀器有限公司）；AR2140電子分析天平（METTLE公司）。

1.2 試藥與材料

1.2.1 對照品 ELITE-AAK氨基酸對照品（18種氨基酸）。

1.2.2 試劑 衍生化試劑為2，4-二硝基氟苯（由大連依利特公司提供）。乙腈為色譜純；冰醋酸，N，N-二甲基酰胺為分析純；水為純凈水。

1.2.3 材料 哈蟆油商品藥材于2010年6月購于各產地，經遼寧中醫藥大學李峰教授鑒定均為正品，具體生境及產地見表1。

表1 哈蟆油商品藥材生境與產地

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為依利特公司氨基酸分析專用ODS柱，柱溫：27℃；檢測波長360 nm；流動相總流速1.2 mL·min－1，梯度洗脫，流動相梯度曲線見表2。

表2 流動相梯度洗脫曲線

2.2 流動相的配制

流動相a為乙腈－水（1∶1）；流動相b為流動相固體組分B 4.1 g加水950 mL，用冰醋酸調pH至6.4～6.8，加10mLN，N-二甲基酰胺，置1 000mL量瓶，以水定容，搖勻，備用。

2.3 衍生緩沖溶液的配制

稱取衍生緩沖溶液固體組分A 1.24 g，固體組分B 7.063 g，置500 mL量瓶中，以水定容，搖勻，備用。

2.4 平衡緩沖溶液的配制

稱取平衡緩沖溶液固體組分A 0.91 g，固體組分B 3.58 g，置250 mL量瓶中，以水定容，搖勻，備用。

2.5 對照品溶液的制備

取ELITE-AAK氨基酸對照品適量，精密稱取，用衍生緩沖溶液定容置250 mL容量瓶中，混勻，備用。

2.6 供試品溶液的制備

稱取表1中各樣品粉末適量（過40目篩，每份約80 mg），精密稱定，置具塞試管中，再加入3 mL 6 mol·L－1鹽酸，混勻，放入烘箱中110℃水解24 h。將水解后樣品從具塞試管轉入蒸發皿中，多次用水洗滌，洗液一并轉入蒸發皿中，80℃水浴蒸干。以衍生緩沖溶液多次洗滌蒸發皿，洗液轉入25 mL容量瓶中，并用衍生緩沖溶液定容，混勻，以0.45μm微孔濾膜過濾。取已過濾的樣品液5 mL置25 mL棕色容量瓶中，加衍生化試劑5 mL，混勻，于60℃水浴中，暗處反應1 h，反應完畢，取出冷卻至室溫，加平衡緩沖溶液定容，混勻，以0.45μm微孔濾膜過濾，備用。

2.7 標準曲線的繪制

分別精密量取2.5項下的對照品溶液5，10，15，20μL，按2.1項下的色譜條件，進樣測定，以各氨基酸對照品溶液的進樣量為橫坐標X，其相應的峰面積值為縱坐標Y，繪制標準曲線，各氨基酸成分的回歸方程及線性范圍見表3。

表3 各氨基酸的回歸方程及線性范圍

2.8 方法學考察

2.8.1 精密度試驗 取3＃供試品溶液，按2.1項下色譜條件，連續進樣5次測定，各色譜峰的相對保留時間的 RSD≤0.53%、相對峰面積的 RSD≤2.8%，表明儀器精密度良好。

2.8.2 重現性試驗 取3＃樣品5份粉末適量（過40目篩，每份約80 mg），精密稱定，按2.6項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件，進樣測定，各色譜峰的相對保留時間的RSD≤0.62%、相對峰面積的RSD≤2.9%，表明方法重現性良好。

2.8.3 穩定性試驗 取3＃供試品溶液，按2.1項下色譜條件，于2、4、8、10、24 h進樣測定，各色譜峰的相對保留時間的RSD≤0.49%、相對峰面積的RSD≤2.6%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.8.4 加樣回收率試驗 分別取已知含量的3＃樣品5份粉末適量（過40目篩，每份約40 mg），精密稱定，并分別精密加入2.5項下的對照品溶液，按2.6項方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件，進樣測定，計算加樣回收率的RSD≤1.67%。

2.9 含量測定

分別精密量取各供試品溶液10μL，按2.1項下的色譜條件，進樣測定，分別測定各供試品溶液的18種氨基酸的色譜峰峰面積，依據標準曲線的回歸方程，計算各氨基酸的含量見表4、5。

表4 林下產哈蟆油商品藥材中氨基酸種類及含量/%

表5 稻田產哈蟆油商品藥材中氨基酸種類及含量/%

3 小結與討論

由表4、5可見，26份產于東北地區林下與稻田的哈蟆油藥材中，均含所檢測的18種氨基酸，其中包括8種人體必需氨基酸（與已有文獻報道的一致［3-5］）；且各種樣品中氨基酸的含量均存在一定差異，因此，檢測哈蟆油藥材中氨基酸的含量，對于控制哈蟆油商品藥材質量具有一定意義。

分別比較表4、表5中，同一生境下不同地區的哈蟆油藥材中氨基酸含量進行比較發現，林下產哈蟆油藥材中，以吉林的必需氨基酸含量最高，總氨基酸含量以遼寧的最高，兩者均以吉林的含量最低；稻田產哈蟆油藥材中，必需氨基酸與總氨基酸含量，均以遼寧的含量最高，以黑龍江的含量最低；這可能哈蟆油藥材傳統主產區及該動物自然分布有關。

將表4與表5數據進行比較，發現同一地區的兩種生境所產哈蟆油藥材氨基酸含量（氨基酸總量均值及必需氨基酸總量均值）均是林下產的高于稻田產的。這與目前藥材市場上認為林下產哈蟆油藥材質量較好相一致。

有關哈蟆油藥材中氨基酸種類及含量分析已有報道，姜大成等［5］對不同地域產哈蟆油中氨基酸的含量進行了測定，曲婷婷［6］對黑龍江中部地區林蛙油氨基酸含量進行了測定分析。本實驗測定哈蟆油藥材中氨基酸含量較以上報道中哈蟆油藥材中氨基酸含量稍低，這與樣品處理方法、測定條件、樣品采集時間、樣品生境及地區不同有關。

有關氨基酸組分分析方法，有氨基酸自動分析儀分析法［5-8］、高效液相色譜法及毛細管電泳法［9］，本實驗采用的是氨基酸自動分析儀分析法。

［1］國家藥典委員會.中國藥典［S］.一部.北京：中國醫藥科技出版社，2010：239.

［2］江蘇新醫學院.中藥大辭典［M］.下冊.上海：上海人民出版社，1977：1651.

［3］王紅燕，徐綏緒.哈蟆油化學成分與藥理研究概況［J］.中成藥，1998，20（9）：39.

［4］李成義，李運春，葉漢光.中國林蛙中氨基酸含量的研究［J］.白求恩醫科大學學報，1991，1（4）：351-353.

［5］姜大成，肖井雷.名貴中藥哈蟆油質量評價的初步研究［J］.吉林中醫藥，2010，30（5）：429-431.

［6］曲婷婷.黑龍江省中部地區中國林蛙油營養成分的比較［D］.東北林業大學，2005：16，19-21.

［7］劉繼紅，尚娟，賈斌，等.蜈蚣、全蝎、地龍氨基酸含量測定［J］.鄭州大學學報（醫學版），2005，40（3）：483.

［8］李澤鴻，姚玉霞，等.二杠鹿茸與三杈鹿茸中氨基酸含量的比較［J］.氮基酸和生物資源，2003，25（1）：10-11.

［9］賈薇，陳濤，李進.中藥中氨基酸含量測定的研究概況［J］.天津藥學，2009，21（5）：50-52.

Comparative and Analysis the Composition of Amino Acids in Ranae Oviductus Medicinal Materials in Two Kinds of Habitat and Different Areas

WANG Dian-bo，LIFeng，ZHANG Zhen-qiu
（Liaoning University of traditional Chinese Medicine，Dalian116600）

Objective：Compare the content of amino acids in Ranae Oviductus medicinal materials in two kinds of habitat，provides the basis for evaluating the quality of the medicinal materials.Methods：Hydrolysis in 6 moL·L－1hydrochloric acid in 110℃ for 24 h，add derivative of reagent 2，4-2 nitro fluorine benzene，in 60℃water derivative 1 h，P230IIYiLiTe amino acids automatic analyzer analysis.Results：The content of amino acids in Ranae Oviductus medicinal materials in the same area，in the forests are higher than in the rice fields in common；in the same habitat，in the forest of jilin is the highest，in the rice field of Liaoning is the highest.Conclusion：The contents of amino acid in Ranae Oviductus medicinal materials for quality evaluation is feasible.

Ranae Oviductus；Amino acids；Two kinds of habitat and different areas；Content comparison

2011-10-31）

國家自然基金資助項目（30973881），沈陽市科技局資助項目（1081238-1-00）

*［通訊作者］李峰，E-mail：zhanglijiayi＠163.com