非小細胞肺癌組織MIP-1表達及其與樹突狀細胞浸潤的關系

彭大勇,李東斌,李 俊,文 亢,趙文靜

(江蘇省南京市上海梅山醫院,1.腫瘤科;2.病理科,江蘇南京,210039)

非小細胞型肺癌包括鱗癌、腺癌、大細胞癌,與小細胞癌相比其癌細胞生長分裂較慢,擴散轉移相對較晚,非小細胞肺癌約占肺癌總數的80%～85%[1-2]。趨化因子是指具有吸引白細胞移行到感染部位的一些低分子量趨化因子(多為8-10KD)的蛋白質(如 IL-8、MCP-1等),在炎癥反應中具有重要作用[3-4]。現代研究發現[5],巨噬細胞炎性蛋白-1(MIP-1)可以增加黏合素在中性粒細胞上的表達,參與細胞生長、分化、凋亡及組織損傷等過程,目前MIP-1與腫瘤的發生發展已成為了近代研究的熱點。本項目通過研究肺癌組織的MIP-1表達與浸潤樹突狀細胞表面趨化因子受體CCR1、CCR7表達的關系,旨在初步探討肺癌的免疫逃逸機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2007年2月～2010年6月來本院胸外科進行手術治療的74例非小細胞肺癌作為研究對象,患者術前均未實施放療或化療。74例肺癌患者中男 56例,女 18例,年齡 35～72歲,平均(56.8±7.9)歲。經病理學檢查:鱗癌31例,腺癌26例,大細胞癌12例,其他類型 5例;按照 1997年國際抗癌聯盟(UICC)修訂的標準,本研究對患者進行TNM分期:Ⅰ期13例,Ⅱ期31例,Ⅲ期25例(ⅢA期16例,ⅢB期5例),Ⅳ期5例。

1.2 試劑

CCR1,CCR7多克隆抗體及MIP-1原位雜交檢測試劑盒均購自上海朗頓生物技術有限公司,其余生化試劑均購自上海朗晟生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學[6]:標本均采用10%的中型甲醛進行固定,采用甲醛固定的石蠟法進行包埋。采用SYD-S2020切片機切成約5 μ m的薄片,以PBS洗滌2次,每次5 min;再采用二甲苯及梯度乙醇脫蠟至水,抗原微波修復,3%H2O2(80%甲醇)滴加在 TMA上,室溫靜置10 min,再以PBS洗滌2～3次;滴加正常山羊血清封閉液,室溫20 min,甩去多余液體,滴加Ⅰ抗 50 μL,室溫靜置1 h或者4℃過夜或者37℃1 h,PBS洗3次各 5 min;滴加Ⅱ抗 40～50 μL,室溫靜置,或37℃1 h,二抗中可加入0.05%tween-20,PBS洗3次各5 min;最后加入抗CCR7多克隆抗體,4℃過夜,再依次加入二抗及卵白素過氧化物酶,DAB顯色;以滴加PBS液代替Ⅰ抗作陰性對照。

1.3.2 熒光原位雜交[7]:嚴格按照博士德公司說明書MIP-1原位雜交檢測方法進行操作,首先將切片脫蠟至水化,再在切片上滴加3%檸檬酸稀釋的胃蛋白酶消化液,37℃消化處理15 min,然后再以適量蒸餾水進行沖洗,繼續以1%低聚甲醛室溫固定10 min。雜交過程,在每張切片上滴加20 μL雜交液,放置于38℃恒溫箱內進行雜交過夜。雜交結束后,在37℃溫度下,采用SSC洗脫液進行洗滌,程序如下:2×SSC洗脫液處理 2次,每次2 min,0.5×SSC洗滌處理2 min,0.2×SSC洗滌處理15 min,最后滴加適量過氧化物酶,于37℃條件下室溫30 min,最后采用PBS進行洗滌。

2 結 果

2.1 肺癌組織中MIP-1、CCR1、CCR7表達

免疫組織化學染色結果顯示,MIP-1陽性染色細胞為胞膜或胞質有綠色熒光物質表達,癌旁組織中無MIP-1陽性染色細胞出現。CCR1、CCR7陽性表達細胞,為棕黃色或棕褐色,細胞形態各異,呈不規則樣分布,有些細胞表面具有較多突起,少許腫瘤細胞核個體較大、胞質也比較豐富,與樹突狀細胞形態存在顯著性差別。

2.2 肺癌組織中MIP-1 、CCR1、CCR7表達與肺癌分期關系

隨機抽取Ⅲ、Ⅳ期及Ⅰ、Ⅱ期肺癌組織MIP-1、CCR1、CCR7陽性染色切片,將每張切片上陽性染色細胞計數,取平均值。具體數據見表1,Ⅲ、Ⅳ期肺癌組織中MIP-1陽性腫瘤細胞數量顯著多于Ⅰ、Ⅱ期,且差異具有統計學意義。Ⅲ、Ⅳ期肺癌組織中CCR1陽性樹突狀細胞數量明顯多于Ⅰ、Ⅱ期,Ⅲ、Ⅳ期肺癌組織中CCR7陽性樹突狀細胞數量明顯少于Ⅰ、Ⅱ期,差異均有統計學意義,表明 MIP-1、CCR1和CCR7陽性樹突狀細胞的表達和肺癌分期相關。

表1 不同臨床分期患者肺癌組織中MIP-1 、CCR1、CCR7陽性細胞計數(n=10,個)

2.3 肺癌組織MIP-1與CCR1,CCR7陽性樹突狀細胞表達的關系

肺癌組織MIP-1陽性表達與CCR1陽性樹突狀細胞呈正相關(r=0.1427,P=0.017);肺癌組織MIP-1陽性表達與CCR7陽性細胞浸潤呈明顯負相關(r=-0.2148,P=0.023)。

3 討 論

MIP-1屬趨化因子CC家族,是趨化因子受體CCR1的配體,在炎癥反應過程中發揮越來越重要的作用。目前,關于趨化因子的研究已經成為當今國內外醫學生物學研究的熱點之一,它可以快速誘導炎性細胞應答與介導免疫細胞募集和活化。

MIP-1對單核細胞具有趨化活性,可以通過信號轉導系統激活單核細胞及巨噬細胞。活化的單核細胞、巨噬細胞的包漿內鈣離子濃度升高,超氧陰離子濃度升高,并可以釋放溶菌酶,進而上調黏附分子表達水平和相關細胞因子產生,抑制腫瘤細胞生長。除了對單核細胞、巨噬細胞的作用外,MIP-1還可以對嗜堿性粒細胞發揮趨化和激活的作用,導致其脫顆粒和釋放組胺增加。處于啟動、調控、并維持免疫應答的中心環節。CCR1,CCR7為樹突狀細胞表面兩個重要的標記分子,CCR1通過與其配體MIP-1的結合激發一系列生化反應,改變周圍細胞的黏附性,便于將細胞信號定位到腫瘤部位。趨化因子受體CCR7(CC chemokine receptor 7)在多種免疫細胞上表達,它及其配體在引導這些細胞向淋巴組織或器官歸巢中起主導作用。最近的研究發現[8-9],CCR7在惡性腫瘤細胞上高度表達,并且在腫瘤細胞淋巴道轉移過程中起重要作用。

本研究結果發現,肺癌組織MIP-1表達中可檢測到表面表達CCR1及CCR7的樹突狀細胞,且Ⅲ、Ⅳ期肺癌組織中樹突狀細胞CCR1陽性表達顯著高于Ⅰ、Ⅱ期。分析可能的原因是MIP-1通過趨化功能,吸引更多未成熟樹突狀細胞到達腫瘤局部,而這些細胞無法激發腫瘤特異殺傷性T細胞,甚至誘導產生無能T細胞,從而導致機體免疫應答反應相對較弱,具體的機制還有待于進一步的研究證實。

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