乏氧條件下PTEN、KAI1基因雙轉染對胰腺癌AsPC1細胞增殖、轉移的影響

李宏宇 李建軍 郭曉鐘 劉旭 吳春燕 趙佳鈞 陳延志

·論著·

乏氧條件下PTEN、KAI1基因雙轉染對胰腺癌AsPC1細胞增殖、轉移的影響

李宏宇 李建軍 郭曉鐘 劉旭 吳春燕 趙佳鈞 陳延志

目的觀察乏氧環境下PTEN和KAI1基因雙轉染人胰腺癌AsPC1細胞后對其增殖、遷移的影響。方法應用我們前期構建的PTEN和KAI1基因過表達載體同時轉染乏氧環境培養的人胰腺癌AsPC1細胞，采用蛋白質印跡法檢測PTEN和KAI1蛋白的表達，四甲基偶氮唑藍(MTT)法檢測細胞的增殖，克隆形成實驗觀察腫瘤細胞形成集落能力，Transwell小室實驗觀察細胞的遷移能力。結果雙基因轉染后，乏氧培養的AsPC1細胞的PTEN、KAI1蛋白表達量較空載體轉染組細胞增加2.05倍及1.51倍；細胞增殖顯著減緩(0.5比0.8，P=0.000)；克隆形成數顯著下降[(41.67±5.03)個比(86.00±7.81)個，P=0.017)]；細胞遷移能力明顯減弱(0.68±0.05比1.23±0.03，P=0.003)。結論乏氧條件下PTEN、KAI1基因雙轉染AsPC1細胞后能夠抑制其增殖、遷移能力，基因聯合治療胰腺癌可能具有潛在的應用價值。

胰腺腫瘤； 細胞系，腫瘤； 缺氧； 轉染

腫瘤組織內部因血管分布不均一所造成供血供氧不足的乏氧狀態是腫瘤細胞生長的微環境，也是實體腫瘤中十分常見的現象[1]。研究表明，乏氧與腫瘤的抗凋亡、上皮間質轉化(EMT)及血管生成有關，可促進腫瘤的增殖和轉移[2]，同時可降低放、化療及其他治療的效果[3]。本研究將抑癌基因PTEN(phosphatase and tensinhomology deleted on chromo-some ten)和腫瘤轉移抑制基因KAI1聯合轉染乏氧條件下的胰腺癌AsPC1細胞，觀察其對細胞增殖、遷移的影響，探討多基因聯合治療的意義。

材料和方法

一、PTEN和KAI1基因雙轉染

AsPC1細胞株為本科室保存。攜帶PTEN基因的pEAK8質粒(pE-PTEN)和含有KAI1基因的腺病毒(Ad-KAI1)由我們前期構建[4-5]。利用乏氧設備在完全密閉的方盒中持續通入乏氧氣體(1% O2、5% CO2和94% N2)，將處于對數生長期的AsPC1細胞在乏氧環境中培養1周后接種到6孔板。采用Lipofectamine 2000(美國Invotrogen公司)將pE-PTEN和Ad-KAI1共同轉染AsPC1細胞(雙轉染組)，經篩選后擴增培養。以空質粒pEAK8和腺病毒Ad轉染細胞(空轉染組)及未轉染細胞作為對照。

二、蛋白質印跡法

取2×106個雙轉染細胞，裂解后收集細胞總蛋白，常規行蛋白質印跡法檢測PTEN及KAI1蛋白。PTEN抗體及KAI1抗體均購自美國Santa Cruz公司，以GAPDH作為內參，最后ECL發光顯色，采用ImageJ軟件分析灰度值。以空轉染細胞為對照組。

三、四甲基偶氮唑藍(MTT)法

PTEN和KAI1雙轉染的AsPC1細胞接種到96孔板，每孔2×103個細胞，在乏氧環境中培養5 d，每天取5個孔，每孔加入MTT(5 mg/ml)10 μl，4 h后吸出孔內液體，加入DMSO 100 μl，5 min后測各孔490 nm的吸光值(A490值)。以空轉染細胞為對照組。以時間為橫坐標，A490值為縱坐標，繪制細胞生長曲線。

四、克隆形成實驗

將雙轉染組與空轉染組細胞分別接種6孔板，每孔200個細胞，每組設3個復孔，在乏氧環境中培養14 d，中途換液并觀察細胞狀態。實驗終止時PBS洗滌細胞2次，多聚甲醛固定，PBS再洗滌2次，Giemsa染色10 min，去離子水洗滌3次，計數克隆并拍照。

五、Transwell小室實驗

Transwell小室(美國Corning公司)的上室加入無血清培養液懸浮的雙轉染組或空轉染組細胞2×104個，下室加入含30%胎牛血清的培養液，在乏氧環境中培養8 h。倒扣小室于吸水紙上以去除培養液，用棉簽輕拭去小室上層非穿膜細胞，用Giemsa染色30 min，漂洗數次，顯微拍照后10%醋酸溶解，以570 nm的吸光值(A570值)代表細胞的遷移率。

六、統計學處理

結 果

一、轉染效果

雙轉染組細胞的PTEN和KAI1蛋白表達水平明顯升高，分別為空轉染組的2.05倍及1.51倍，而空轉染組與未轉染組間差異無統計學意義(圖1)。

圖1 各組細胞的PTEN(a)和KAI1(b)蛋白表達

二、細胞增殖

雙轉染細胞的增殖速率明顯減緩，從第2天起均較空轉染組細胞顯著降低(P=0.000，圖2)。

圖2 雙轉染組及空轉染組細胞的生長曲線

三、細胞克隆形成

雙轉染組細胞形成>50個細胞的克隆數為(41.67±5.03)個，空轉染組細胞的克隆數為(86.00±7.81)個，雙轉染組顯著低于空轉染組(P=0.017)。同時，顯微鏡下見雙轉染組細胞形成的單個克隆中的細胞數亦較空轉染組少(圖3)。

四、細胞遷移能力

雙轉染組細胞遷移能力較空轉染組明顯降低(圖4)。雙轉染組細胞的遷移率為0.68±0.05，顯著低于空轉染組細胞的1.23±0.03(P=0.003)。

圖3 雙轉染組(a)及空轉染組(b)形成的細胞克隆

圖4 雙轉染組(a)及空轉染組(b)的穿膜細胞(×400)

抑癌基因PTEN是在1997年被分離出的繼P53后另一個較為廣泛與腫瘤關系密切的抑癌基因，位于10號染色體10q23.3，有9個外顯子和8個內含子，是一個高度保守的基因。它調控細胞周期和增殖，抑制細胞的生長[6-8]。我們前期的研究發現，PTEN基因可以使胰腺癌AsPC1細胞阻滯在G2/M期，增加乏氧可誘導AsPC1細胞凋亡以及放射線引起G2/M期細胞阻滯的能力，并且抑制AsPC1細胞在常氧及乏氧情況下的增殖[9-10]。1995年，KAI1/CD82 作為腫瘤轉移抑制基因首次從前列腺癌細胞系中分離出來，其屬于跨膜4超家族(TM4SF),編碼分子質量29 6000的跨膜糖蛋白，具有調節細胞運動、分化和抑制腫瘤轉移的作用[11]。我們前期的研究結果顯示，KAI1基因與人胰腺癌的轉移密切相關。轉染KAI1基因后胰腺癌細胞生長受抑，遷移能力減弱；動物體內實驗也發現經KAI1質粒注射治療的荷瘤鼠的瘤體積縮小，肝、肺的轉移灶數目減少[12-14]。

我們以往的研究只顯示單一基因的作用，未能體現胰腺癌發生、發展中的多基因聯合效應，同時對影響胰腺癌預后和治療敏感性的乏氧環境也缺乏足夠的探討。本研究將PTEN和KAI1基因同時轉染ASPC1細胞，并在接近腫瘤自然生存環境的乏氧環境下培養。結果顯示，在乏氧條件下，PTEN和KAI1雙轉染后能夠抑制細胞的增殖和克隆形成能力，降低細胞的遷移能力，顯示出可喜的應用前景。筆者在此基礎上，將對放療敏感性及動物實驗做進一步驗證，以提供更加有力的證據。

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EffectsofPTENandKAI1doublegenetransfectiononproliferation,metastasisonpancreaticcancerAsPC1cellsunderhypoxiccondition

LIHong-yu,LIJian-jun,GUOXiao-zhong,LIUXu,WUChun-yan,ZHAOJia-jun,CHENYan-zhi.
DepartmentofGastroenterology,ShenyangGeneralHospitalofPLA,Shenyang110840,China

GUOXiao-zhong,Email:guoxiaozhong1962@163.com

ObjectiveTo investigate the effects of PTEN and KAI1 double gene transfection on proliferation, metastasis in AsPC1 pancreatic cancer cells under hypoxic condition.MethodsRecombinant vectors that over expressing PTEN and KAI1 protein which was established previously were double transfected into hypoxic AsPC1 cells. Western blot was performed to measure the expression level of PTEN and KAI1. Then, cell proliferation was detected by MTT, and colony forming assay were used to test the ability of tumor cells forming colonies, and transwell assay was used to evaluate metastatic function.ResultsAfter double gene transfection, both PTEN and KAI1 protein expression was significantly up-regulated, which was 2.05 and 1.51 folds higher than that of empty vector group; and cell proliferation of hypoxic AsPC1 cells was suppressed significantly (0.5vs0.8,P=0.00031), number of colony formation was significantly decreased [(41.67±5.03)vs(86.00±7.81),P=0.017)]; the capacity of metastasis was significantly decreased (0.68±0.05vs1.23±0.03,P=0.0025).ConclusionsDouble gene transfection of PTEN and KAI1 could inhibit proliferation and metastatic activity of hypoxic AsPC1 cells, which might indicate that combined gene therapy may play a role in the treatment of pancreatic cancer.

【Keywrods】 Pancreatic neoplasms; Cell line, tumor; Anoxia; Transfection

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.02.014

遼寧省博士啟動基金(20081044)；遼寧省教育廳基金(L2010627)

110840 沈陽，沈陽軍區總醫院消化內科(李宏宇、郭曉鐘、劉旭、吳春燕、趙佳鈞)；中國醫科大學附屬第一醫院放療科(李建軍、陳延志)

郭曉鐘，Email: guoxiaozhong1962@163.com

2011-06-28)

(本文編輯：呂芳萍)