MMI-166對人胰腺癌細胞株SW1990體外增殖及凋亡的影響

鞏本剛 徐懷勇 成丕光 高崇崇 吳俊本

·論著·

MMI-166對人胰腺癌細胞株SW1990體外增殖及凋亡的影響

鞏本剛 徐懷勇 成丕光 高崇崇 吳俊本

目的探討基質金屬蛋白酶抑制劑MMI-166對人胰腺癌SW1990細胞增殖和凋亡的影響。方法應用不同濃度(25、50、100 μg/ml)的MMI-166處理人胰腺癌SW1990細胞24、48 h。用四甲基偶氮唑藍(MTT)法檢測細胞增殖抑制率；采用Annexin Ⅴ-PI法檢測細胞凋亡，流式細胞術檢測細胞凋亡率。結果25、50、100 μg/ml MMI-166處理細胞24 h后，細胞生長抑制率分別為(34.23±3.87)%、(44.81±2.01)%、(53.91±1.74)%；48 h的抑制率為(39.95±1.83)%、(52.26±3.46)%、(63.20±2.48)%，呈濃度及時間依賴性。24 h的細胞凋亡率分別為(4.17±0.55)%、(8.22±0.70)%、(14.10±0.44)%；48 h的細胞凋亡率為(11.19±0.47)%、(23.01±0.53)%、(28.10±0.52)%，均顯著高于對照組的(0.09±0.12)%(P<0.05)。結論MMI-166以濃度和時間依賴性抑制胰腺癌SW1990細胞增殖，誘導細胞凋亡。

胰腺腫瘤； 細胞系，腫瘤； 金屬蛋白酶類組織抑制劑； 細胞增殖； 細胞凋亡

基質金屬蛋白酶抑制劑通過抑制基質金屬蛋白酶(MMPs)的活性在胰腺癌治療中發揮重要作用。研究證實，一代、二代MMPs抑制劑具有明顯副作用，因此尋找一種高效低毒的MMPs抑制劑是目前研究方向之一。MMI-166是第三代新型選擇性MMPs抑制劑，可特異性抑制MMP-2、MMP-9活性，從而抑制腫瘤侵襲和轉移[1]。目前國外已有報道，MMI-166在肺癌、直腸癌和胰腺癌等動物實驗中具有抗腫瘤浸潤、轉移作用[2-4]。本研究觀察MMI-166對人胰腺癌細胞SW1990增殖和凋亡的影響，探討其量效關系。

材料與方法

一、細胞增殖抑制率檢測

人胰腺癌細胞株SW1990購于上海細胞庫，在含有10%胎牛血清的L-15型培養液中培養、傳代。取對數生長期細胞，以每孔1000個細胞接種于96孔板。細胞貼壁后，每孔分別加入終濃度為25、50、100 μg/ml的MMI-166，以不加MMI-166作為對照，繼續培養24、48 h，分別加入5 mg/ml的MTT 20 μl繼續孵育4 h，去培養液，每孔加入DMSO 150 μl，振蕩混勻10 min，上酶標儀測各孔560 nm波長的吸光值(A560值)，以單純培養液調零。每一濃度設6個復孔，實驗重復3次。抑制率=(1-實驗組A560值/對照組A560值)×100%。

二、細胞形態觀察

按每孔1.0×105個SW1990細胞接種于24孔板，細胞貼壁后按上述分為對照組和MMI-166各組繼續培養24、48 h，于倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態變化。

三、細胞凋亡檢測

收集上述各組細胞，用反應緩沖液制成單細胞懸液，密度≥1×105個/ml。取200 μl細胞懸液，加Annexin V 10 μl和PI 2 μl，混勻后室溫避光孵育15 min，取100 μl置熒光顯微鏡下觀察細胞染色。另一半加入400 μl反應緩沖液輕輕振蕩,混勻,上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

四、統計學分析

結 果

一、MMI-166對SW1990細胞的增殖抑制作用

MMI-166呈濃度及時間依賴性抑制SW1990細胞的增殖(P<0.05，表1)。

二、SW1990細胞形態的變化

MMI-166處理后，SW1990細胞數明顯減少，細胞皺縮，遮光性差，細胞膜破碎，隨后貼壁細胞脫落漂浮在培養液中；對照組細胞生長良好(圖1)。

表1 MMI-166對SW1990細胞的增殖抑制率

注：同時間點組間比較，aP<0.05；同濃度組間比較，bP<0.05

圖1對照組(a)及MMI-166 25(b)、50(c)、100 μg/ml(d)組細胞形態(×100)

三、細胞凋亡

正常活細胞Annexin V、PI均低染；凋亡早期細胞Annexin V高染、PI低染，呈綠色熒光；凋亡晚期細胞和壞死細胞Annexin V、PI均高染，呈紅、綠雙色熒光(圖2)。

MMI-166處理后，細胞凋亡率較對照組明顯升高(P<0.05，表2、圖3)。

圖2MMI-166 25(a)、50(b)、100(c)μg/ml組細胞凋亡染色(×100)

表2 各組SW1990細胞的凋亡率

注：與對照組比較，aP<0.05；同濃度組內比較，bP<0.05

圖3對照組(a)及MMI-166 25(b)、50(c)、100μg/ml(d)組細胞凋亡圖(流式細胞儀)

討 論

MMPs是一組鋅離子依賴的分泌蛋白酶，它通過降解細胞外基質(ECM)和基底膜調節細胞間的黏附，促進腫瘤細胞的侵襲和轉移以及腫瘤組織中新生血管的形成，MMP抑制劑通過抑制MMPs的活性，抑制腫瘤侵襲、轉移及腫瘤生長。在Ⅲ期臨床研究中發現第一代MMPs抑制劑marimastat聯合吉西他濱治療晚期胰腺癌療效并不優于單藥吉西他濱[5],并可導致炎癥性關節炎等不良反應。第二代MMPs抑制劑BAY12-9566在體外實驗和Ⅰ期臨床實驗中顯示出較好的抑制腫瘤的效果和更少的不良反應，但Ⅱ期臨床試驗中期分析結果后，因吉西他濱單藥組無進展生存期和中位生存期較聯合治療組顯著延長而被終止[6]。

MMI-166是第三代新型MMPs抑制劑，可選擇性抑制MMP-2、MMP-9的活性。國外研究顯示，MMI-166對多種惡性腫瘤細胞如胃癌、肺癌、結腸癌、頭頸鱗狀細胞癌及膠質瘤等[7-9]具有抗腫瘤侵襲、轉移及抑制腫瘤生長的作用。Wang等[10]報道，MMP-9可酶解E-cad，穩定β-連環蛋白從而激活Wnt信號通路，促進細胞增殖。Meyer等[11]應用MMP siRNA導入結腸腺癌細胞SW480，使細胞免于PKC/p53誘導的凋亡。Chetty等[12]應用MMP-2 siRNA導入A549肺腺癌細胞，可誘導caspase-3、8、9以及PARP-1分裂體形成，誘導Fas/FasL的活化，從而發揮抗凋亡作用。本實驗結果亦證實，MMI-166呈濃度及時間依賴性抑制人胰腺癌SWl990細胞的增殖，并促進細胞凋亡，有望成為一種新的治療胰腺癌的化療藥物。

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EffectsofMMI-166onproliferationandapoptosisinhumanpancreaticcancerSW1990cell

GONGBen-gang,XUHuai-yong,CHENGPi-guang,GAOChong-chong,WUJun-ben.
DepartmentofHepatobiliarySurgery，BinzhouPeople′sHospital,BinzhouMedicalCollege，Shandong256600,China

XUHuai-yong,Email:xhy314552445@163.com

ObjectiveTo investigate the effects of MMI-166 on the proliferation and apoptosis of human pancreatic cancer SW1990 cells.MethodsMMI-166 of different concentrations (25, 50, 100 μg/ml) were used to treat human pancreatic cancer SW1990 cell for 24, 48 h. Effect of MMI-166 on cell proliferation was detected by 3-(4,5-dimethyl-2-thiazole)-2-5-biphenly-tetrazole bromide (MTT) method and effect on cell apoptosis was tested by Annexin V-PI method and flow cytometry (FCM).ResultsTwenty-four hours after MMI-166 treatment of different concentrations (25, 50, 100 μg/ml), the inhibitory rates of the cells were (34.23±3.87)%, (44.81±2.01)%, (53.91±1.74)%, and the corresponding values were (39.95±1.83)%, (52.26±3.46)%, (63.20±2.48)% at 48 h, which suggested a time-and concentration-dependent manner. The cell′s apoptosis rates were (11.19±0.47)%, (23.01±0.53)%, (28.10±0.52)% at 24 h, and the corresponding values were (11.19±0.47)%, (23.01±0.53)%, (28.10±0.52)% at 48 h, which were significantly higher than those in control group [(0.09±0.12)%,P<0.05].ConclusionsMMI-166 can inhibit proliferation and induce apoptosis of human pancreatic SW1990 cell in a time- and concentration-dependent manner.

Pancreatic neoplasms; Cell line, tumor; Tissue inhibitor of metalloproteinases; Cell proliferation; Apoptosis

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.02.008

山東省科技發展計劃項目(2009GG20002096)

256600 濱州，濱州醫學院附屬濱州市人民醫院肝膽外科

徐懷勇，Email：xhy314552445@163.com

2011-09-26)

(本文編輯：屠振興)