5-氮雜-2′-脫氧胞苷對胰腺癌細胞PANC1的組織因子途徑抑制物-2表達及CpG島甲基化的影響

湯志剛 鄭浩 黃強 陳炯

·論著·

5-氮雜-2′-脫氧胞苷對胰腺癌細胞PANC1的組織因子途徑抑制物-2表達及CpG島甲基化的影響

湯志剛 鄭浩 黃強 陳炯

目的探討甲基化酶抑制劑5-氮雜-2′-脫氧胞苷(5-Aza-dC)對胰腺癌細胞系PANC1的抑癌基因組織因子途徑抑制物2(tissue factor pathway inhibitor 2，TFPI-2)甲基化水平及基因表達的影響。方法應用1×10-7、5×10-7、1×10-6mol/L的5-Aza-dC處理胰腺癌細胞系PANC1。用甲基化特異性PCR(MSP)、RT-PCR及蛋白質印跡法檢測細胞TFPI-2基因的甲基化狀態、mRNA及蛋白的表達。結果未經5-Aza-dC處理的PANC1細胞的TFPI-2基因CpG島為完全甲基化，無TFPI-2 mRNA及蛋白的表達。1×10-7、5×10-7、1×10-6mol/L的5-Aza-dC處理后，PANC1細胞的TFPI-2基因CpG島甲基化逆轉，從不完全甲基化到完全非甲基化； TFPI-2 mRNA相對表達量分別為0.211±0.087、0.327±0.068、0.609±0.017；TFPI-2蛋白相對表達量為0.429±0.121、0.675±0.044、1.132±0.124，呈劑量依賴性增加(P<0.05)。結論胰腺癌細胞系PANC1的TFPI-2啟動子高甲基化可能是導致該基因表達下調甚至失活的主要原因。5-Aza-dC能夠逆轉其高甲基化狀態，并誘導TFPI-2 mRNA及蛋白重新表達。

胰腺腫瘤； 甲基化； 組織因子途徑抑制物2； 5-氮雜-2′-脫氧胞苷

胰腺癌的發生發展涉及到多個抑癌基因的異常改變，而抑癌基因的失活又涉及多種途徑。其中抑癌基因啟動子區CpG島的高甲基化被認為是導致抑癌基因表達沉默甚至失活的主要原因之一[1]。人類組織因子途徑抑制物-2(TFPI-2)，又名胎盤蛋白-5，是一種絲氨酸蛋白酶抑制劑。它能夠抑制細胞外基質(ECM)的降解，抑制腫瘤新生血管的生成，誘導腫瘤細胞的凋亡，從而在抑制腫瘤細胞的浸潤和轉移等一系列生理病理過程中發揮重要的作用[2-3]。本實驗應用甲基化酶抑制劑5-Aza-dC干預胰腺癌細胞株PANC1，觀察TFPI-2 mRNA、蛋白表達的變化及基因的甲基化狀態改變，探討胰腺癌的發生機制。

材料與方法

一、DNA抽提

胰腺癌PANC1細胞系購自南京凱基生物公司，常規培養、傳代。1例正常胰腺組織取自安徽省立醫院普外科膽胰病區外傷剖腹探查者，征得患者及家屬同意，作為陰性對照。5-Aza-dC購自MERCK公司。取對數生長期細胞，應用1×10-7、5×10-7、1×10-6mol/L的5-Aza-dC處理PANC1細胞4 d，以未經5-Aza-dC處理的PANC1細胞作為對照。采用DNA抽取試劑盒(天根公司)提取細胞及組織DNA。

二、甲基化特異性PCR(MSP)

取1 μg DNA，使用DNA修飾試劑盒(EPIGENTEK公司)進行亞硫酸氫鹽修飾。采用Primer Premier5.0軟件設計MSP引物，甲基化引物上游5′-TTTCGTATAAAGCGGGTATTC-3′，下游5′-ACGACC-CGCTAAACAAAACG-3′；非甲基化引物上游5′-GGATGTTTGTTTTGTATAAAGTG-3′，下游5′-AAACATCCAAAAAAACACCTAAC-3′。引物由大連寶生物工程有限公司合成。PCR反應條件：95℃ 20 min；94℃ 30 s、52℃ 30 s、72℃ 45 s，40個循環；72℃ 10 min。擴增產物經電泳分離，凝膠成像系統掃描分析。

三、RT-PCR

取上述各組細胞及正常胰腺組織，用Trizol試劑(Gibco BRL公司)提取總RNA，紫外分光光度計檢測其濃度和純度。TFPI-2引物上游5′-CAGAATTCTATGGACCCCGCTCGCCCC-3′，下游5′-CAGTCG-ACTTAAAATTGCTTCTTCCG-3′。以β-actin作為內參照。先逆轉錄cDNA，再行PCR，反應條件：95℃ 5 min；94℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃ 30 s，30個循環；72℃ 5 min。擴增產物經電泳分離，凝膠成像系統掃描，以目的基因條帶與β-actin條帶吸光值比值作為TFPI-2 mRNA的相對表達量。

四、蛋白質印跡法

取上述各組細胞及正常胰腺組織，采用RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑PMSF冰上裂解30 min。4℃離心取上清液，Bradford法行蛋白定量后再行蛋白質印跡法檢測TFPI-2蛋白。TFPI-2單抗(Santa Cruz公司)工作濃度1∶500，HRP標記的兔抗鼠IgG工作濃度1∶10000，最后ECL發光。以目的基因條帶與β-actin條帶吸光值比值作為TFPI-2蛋白的相對表達量。

五、統計學處理

結 果

一、PANC1細胞TFPI-2基因甲基化狀態

對照組細胞只有甲基化引物擴增出條帶，為完全甲基化；1×10-7、5×10-7mol/L 5-Aza-dC處理的PANC1細胞甲基化及非甲基化引物均擴增出條帶，為不完全甲基化；1×10-6mol/L 5-Aza-dC處理的PANC1細胞只有非甲基化引物擴增出條帶，為非甲基化(圖1)。

M:甲基化產物;U:非甲基化產物

圖1空白對照(1)、正常胰腺(2)、PANC1細胞(3)及經1×10-7、5×10-7、1×10-6mol/L 5-Aza-dC處理的PANC1細胞(4～6)的TFPI-2基因甲基化狀態

二、各組PANC1細胞TFPI-2 mRNA表達

PANC1細胞不表達TFPI-2 mRNA；1×10-7、5×10-7、1×10-6mol/L 5-Aza-dC處理后的PANC1細胞均表達TFPI-2 mRNA(圖2)，相對表達量分別為0.211±0.087、0.327±0.068、0.609±0.017,兩兩濃度組間的差異均具有統計學意義(P=0.039、0.044)。

三、各組PANC1細胞TFPI-2蛋白表達

PANC1細胞不表達TFPI-2蛋白；1×10-7、5×10-7、1×10-6mol/L 5-Aza-dC處理后的PANC1細胞均表達TFPI-2蛋白(圖3)，相對表達量分別為0.429±0.121、0.675±0.044、1.132±0.124，兩兩濃度組間的差異均具有統計學意義(P=0.006、0.045)。

圖2空白對照(1)、正常胰腺(2)、PANC1細胞(3)及經1×10-7、5×10-7、1×10-6mol/L 5-Aza-dC處理的PANC1細胞(4～6)的TFPI-2 mRNA表達

圖3空白對照(1)、正常胰腺(2)、PANC1細胞(3)及經1×10-7、5×10-7、1×10-6mol/L 5-Aza-dC處理的PANC1細胞(4～6)的TFPI-2 蛋白表達

討 論

已經有研究證實，在多種腫瘤中TFPI-2的表達明顯減弱，甚至失活[4-9]。而導致該基因失活的主要原因可能是CpG島啟動子區高甲基化的狀態。5-Aza-dC作為一種甲基化酶抑制劑，能與DNA甲基化酶共價結合，抑制該酶的甲基化轉移活性，逆轉腫瘤細胞的基因甲基化，恢復mRNA轉錄活性和蛋白表達。

本研究結果顯示，未經5-Aza-dC 處理的PANC1細胞TFPI-2基因啟動子區為完全甲基化狀態。經不同濃度5-Aza-dC處理后，細胞的TFPI-2基因的甲基化狀態得到了不同程度的逆轉，TFPI-2 mRNA及蛋白的表達呈濃度依賴性地重新表達，表明該藥物確能逆轉基因異常的高甲基化狀態，并通過啟動子區甲基化程度的降低而恢復其轉錄活性，發揮其抑制腫瘤的作用。

[1] 劉楓, 李兆中, 許國銘, 等. 特異性PCR法檢測胰腺癌p16基因甲基化改變. 胰腺病學, 2002,2,82-84.

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Effectof5-Aza-dConthemethylationandexpressionofTFPI-2geneinpancreaticcancerPANC1cellline

TANGZhi-gang,ZHENGHao,HUANGQiang,CHENJiong.
DepartmentofGeneralSurgery,AffiliatedProvincialHospital,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230001,China

TANGZhi-gang,Email:tangzg7031@163.com

ObjectivesTo investigate the effects of 5-aza-2-deoxycytidine(5-Aza-dC), a methylation inhibitor, on the expression and methylation of tissue factor pathway Inhibitor (TFPI-2) gene in PANC1 cell line of pancreatic cancer.MethodsPANC1 cell lines were treated with different dosages of 5-Aza-dC (1×10-7, 5×10-7, 1×10-6mol/L). The status of TFPI-2 methylation and expressions of TFPI-2 mRNA and protein were determined by MSP, RT-PCR, and Western blot.ResultsTFPI-2 gene CpG island was completely methylated, and there was no expression of TFPI-2 mRNA and protein without 5-Aza-dC treatment. After treatment with different dosages of 5-Aza-dC(1×10-7, 5×10-7, 1×10-6mol/L), TFPI-2 gene CpG hypermethylation was reversed from incomplete methylated to complete non-methylated. The relative expressions of TFPI-2 mRNA were 0.211±0.087, 0.327±0.068, 0.609±0.017; and the relative expressions of TFPI-2 protein were 0.429±0.121, 0.675±0.044, 1.132±0.124 in a dose-dependent manner (P<0.05).ConclusionsThe hypermethylation of promoter region may be the primary reason for TFPI-2 gene expression down-regulation and inactivation. 5-Aza-dC may reverse the hypermethylation of TFPI-2 gene, and induce the re-expression of TFPI-2 mRNA and protein.

Pancreatic neoplasms; Methylation; Tissue factor pathway inhibitor 2; 5-Aza-dC

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.02.006

國家自然科學基金(81071734)

230001 合肥，安徽醫科大學附屬省立醫院普外科

湯志剛，Email:tangzg7031@163.com

2011-05-27)

(本文編輯：呂芳萍)