缺氧對(duì)胰腺癌PANC1細(xì)胞增殖、凋亡及遷移的影響

朱亮 徐勝南 龐慧芳 趙慧貞 覃華 黎培員 李德民 趙秋

·論著·

缺氧對(duì)胰腺癌PANC1細(xì)胞增殖、凋亡及遷移的影響

朱亮 徐勝南 龐慧芳 趙慧貞 覃華 黎培員 李德民 趙秋

目的探討氯化鈷(CoCl2)模擬缺氧對(duì)人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC1增殖、凋亡和遷移的影響。方法分別用終濃度為0(對(duì)照)、100、200、400、800 μmol/L CoCl2處理PANC1細(xì)胞24 h，采用實(shí)時(shí)定量PCR、蛋白質(zhì)印跡法分別檢測(cè)細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF) mRNA及蛋白的表達(dá)，采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，細(xì)胞劃痕試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力。結(jié)果對(duì)照組及100、200、400、800 μmol/L CoCl2處理組HIF-1α mRNA表達(dá)量分別為 1、1.08±0.12、1.12±0.09、1.04±0.11、0.66±0.07；VEGF mRNA表達(dá)量分別為1、2.69±0.35、4.81±0.54、2.19±0.21、0.79±0.08；HIF-1α蛋白表達(dá)量為0.23±0.03、0.36±0.04、1.15±0.11、1.08±0.09、0.44±0.04；VEGF蛋白表達(dá)量為0.14±0.02、0.12±0.01、0.95±0.09、0.87±0.09、0.55±0.06；細(xì)胞存活率分別為100%、(98.43±2.88)%、(76.15±0.70)%、(53.87±0.77)%、(35.23±0.67)%；細(xì)胞凋亡率分別為(5.2±1.12)%、(5.74±1.07)%、(6.82±1.85)%、(12.09±3.53)%、(31.88±6.95)%；細(xì)胞爬行距離分別為(43.24±3.67)%、(59.46±5.39)%、(80.56±8.05)%、(63.89±5.96)%、(9.09±1.59)%。與對(duì)照組相比較，處理組細(xì)胞VEGF mRNA、VEGF及HIF-1α蛋白表達(dá)、細(xì)胞爬行距離均呈先上升后下降的趨勢(shì)(P<0.05)，HIF-1α mRNA 表達(dá)、細(xì)胞增殖率呈劑量依賴性降低，細(xì)胞凋亡率呈劑量依賴性升高。結(jié)論CoCl2達(dá)到一定濃度時(shí)可顯著抑制PANC1細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；CoCl2對(duì)PANC1細(xì)胞遷移效應(yīng)的雙向作用與高濃度CoCl2對(duì)細(xì)胞直接損傷有關(guān)。

胰腺腫瘤； 缺氧； 氯化鈷； 細(xì)胞增殖； 細(xì)胞凋亡； 細(xì)胞運(yùn)動(dòng)

研究表明，大多數(shù)實(shí)體瘤內(nèi)部微環(huán)境處于缺氧狀態(tài)，且這種缺氧環(huán)境是促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的重要因素之一。氯化鈷(CoCl2)是一種化學(xué)制劑，由于其特殊的化學(xué)性能，常用于體外誘導(dǎo)化學(xué)缺氧，并在細(xì)胞增殖、遷移、應(yīng)激反應(yīng)等研究中廣泛應(yīng)用。本研究通過CoCl2體外化學(xué)反應(yīng)模擬缺氧環(huán)境，觀察其對(duì)人胰腺癌細(xì)胞系PANC1增殖、凋亡及遷移的影響。

材料與方法

一、細(xì)胞培養(yǎng)及分組

人胰腺癌細(xì)胞系PANC1由本院肝病研究所保存。解凍后置含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)、傳代。分別應(yīng)用終濃度為0(對(duì)照)、100、200、400、800 μmol/L的CoCl2(美國Sigma公司)干預(yù)細(xì)胞24 h。

二、mRNA表達(dá)檢測(cè)

取上述分組培養(yǎng)的細(xì)胞，采用Trizol(Invitrogen公司)提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增。引物序列：細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α上游5′-TGAAGTGTACCCTAACTAGCCG-3′，下游5′-TTCACAAATCAGCACCAAGC-3′，擴(kuò)增片段164 bp；VEGF上游5′-AACCATGAACTTTCTGCTGTCTTG-3′，下游5′-TTCACCACTTCGTGATGATTCTG-3′， 擴(kuò)增片段129 bp；內(nèi)參β-actin上游5′-GTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3′，下游5′-GACTGCTGTCACCTTCACCGT-3′，擴(kuò)增片段157 bp。PCR反應(yīng)條件：95℃ 60 s, 95℃ 15 s、60℃ 30 s， 40個(gè)循環(huán)。mRNA相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCt計(jì)算，ΔCt=Ct處理組-Ct對(duì)照組。以對(duì)照組mRNA表達(dá)量為1。

三、蛋白表達(dá)檢測(cè)

取上述分組培養(yǎng)的細(xì)胞，采用RIPA蛋白裂解液裂解，提取細(xì)胞總蛋白，Bradford法測(cè)定蛋白濃度。常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡法。兔抗人HIF-1α、VEGF、β-actin多抗分別購自美國Santa Cruz公司、武漢博士德公司、美國Proteintech公司，工作濃度分別為1∶400、1∶400、1∶1000，最后ECL發(fā)光。用BioDoc-It 220凝膠成像系統(tǒng)(美國UVP公司)以及ImageJ分析軟件對(duì)圖像條帶作半定量分析。

四、細(xì)胞增殖檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長期PANC1細(xì)胞，按每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞生長至60%融合度時(shí)分成上述各組培養(yǎng)24 h，每孔加入10 μl CCK-8(日本Dojindo公司)，避光培養(yǎng)2 h。每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔。在酶標(biāo)儀上測(cè)定450 nm波長的吸光度(A450值)，以對(duì)照組細(xì)胞存活率為100%，細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組A450值/對(duì)照組A450值×100%。

五、細(xì)胞凋亡檢測(cè)

取上述各組培養(yǎng)的細(xì)胞，PBS洗2次后用培養(yǎng)液制備單細(xì)胞懸液。收集5×105個(gè)細(xì)胞，按照Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒(南京凱基公司)說明書操作，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

六、細(xì)胞遷移試驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長期PANC1細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞長滿孔板時(shí)，取黃色槍頭(200 μl)尖垂直板底制造人工劃痕，記錄初始劃痕距離。PBS洗2遍后加入無血清培養(yǎng)基，并分成上述各組培養(yǎng)24 h，記錄劃痕距離。細(xì)胞爬行距離=細(xì)胞爬行距離/初始劃痕距離×100%。

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、PANC1細(xì)胞HIF-1α、VEGF mRNA表達(dá)的變化

對(duì)照組及100、200、400、800 μmol/L CoCl2處理組HIF-1α mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1、1.08±0.12、1.12±0.09、1.04±0.11、0.66±0.07，800 μmol/L組細(xì)胞HIF-1α mRNA表達(dá)較對(duì)照組顯著降低(F=70.776，P<0.05)，其他各組表達(dá)無顯著改變；VEGF mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1、2.69±0.35、4.81±0.54、2.19±0.21、0.79±0.08，100、200、400 μmol/L組均較對(duì)照組顯著升高(F=20.280、195.323、240.833，P值均<0.05)，其中200 μmol/L組達(dá)峰值，800 μmol/L組恢復(fù)到正常水平，呈先上升后下降趨勢(shì)。

二、PANC1細(xì)胞HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)的變化

對(duì)照組及100、200、400、800 μmol/L CoCl2處理組HIF-1α蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.23±0.03、0.36±0.04、1.15±0.11、1.08±0.09、0.44±0.04；VEGF蛋白表達(dá)量分別為0.14±0.02、0.12±0.01、0.95±0.09、0.87±0.09、0.55±0.06(圖1)。≥200 μmol/L各組均較對(duì)照組顯著升高(F=195.323、240.833、52.920；231.565、188.082、126.075；P值均<0.05)，其中200 μmol/L組達(dá)峰值，呈先上升后下降趨勢(shì)。

圖1 各組PANC1細(xì)胞HIF-1α 、VEGF蛋白的表達(dá)

三、PANC1細(xì)胞增殖的變化

對(duì)照組及100、200、400、800 μmol/L CoCl2處理組細(xì)胞存活率分別為100%、(98.43±2.88)%、(76.15±0.70)% 、(53.87±0.77)%、(35.23±0.67)%，呈濃度依賴性抑制細(xì)胞增殖。≥200 μmol/L各組較對(duì)照組顯著下降(F=3454.390、89391.356、38591.953，P值均<0.05)。且各組間存活率差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2607.256、2628.763,P值均<0.01)。

四、PANC1細(xì)胞凋亡的變化

對(duì)照組及100、200、400、800 μmol/L CoCl2處理組細(xì)胞凋亡率分別為(5.2±1.12)%、(5.74±1.07)%、(6.82±1.85)%、(12.09±3.53)%、(31.88±6.95)%(圖2)。400、800 μmol/L組細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組顯著升高(F=10.384,43.091,P值均<0.05)， 400 μmol/L組以早期凋亡為主，800 μmol/L組以晚期凋亡為主。

圖2 各組PANC1細(xì)胞的凋亡

五、PANC1細(xì)胞遷移的變化

對(duì)照組及100、200、400、800 μmol/L CoCl2處理組細(xì)胞爬行距離分別為(43.24±3.67)%、(59.46±5.39)%、(80.56±8.05)%、(63.89±5.96)%、(9.09±1.59)%(圖3)。100、200、400 μmol/L組均較對(duì)照組顯著增加(F=18.562、53.383、26.113，P值均<0.05)，其中200 μmol/L組達(dá)峰值，而800 μmol/L組較對(duì)照組顯著減少(F=218.708,P<0.05)，呈先上升后下降趨勢(shì)。

圖3 各組PANC1細(xì)胞遷移的變化

討 論

在實(shí)體腫瘤中，由于腫瘤細(xì)胞生長失控、新生血管結(jié)構(gòu)紊亂、供給血管和腫瘤生長不相適應(yīng)，腫瘤內(nèi)部往往處于缺血缺氧狀態(tài)，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤對(duì)化療和放療抵抗[1]。另一方面，腫瘤可通過一系列生物學(xué)活性變化在缺氧環(huán)境下生存，其中缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α的激活是維持腫瘤細(xì)胞存活的重要因素之一。HIF-1α可通過調(diào)控多種靶基因如VEGF、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子(GLUT) 等表達(dá)促進(jìn)新生血管生成，調(diào)控腫瘤能量代謝以逃避或適應(yīng)相對(duì)低氧環(huán)境，促進(jìn)腫瘤生長、浸潤和轉(zhuǎn)移[2]。

使用CoCl2模擬缺氧是各種實(shí)驗(yàn)性缺氧培養(yǎng)研究中經(jīng)常使用的方法。Co2+是鐵螯合酶的底物，可替代氧感受器血紅素中的Fe2+，阻斷氧感受器與氧結(jié)合，從而模擬缺氧狀態(tài)。本研究結(jié)果顯示，在CoCl2模擬的輕度缺氧模型下(≤200 μmol/L)，HIF-1α mRNA表達(dá)未見顯著升高，而HIF-1α蛋白及其靶基因VEGF表達(dá)水平升高，提示缺氧誘導(dǎo)的HIF-1表達(dá)主要在轉(zhuǎn)錄后水平，這與Guo等[3]在神經(jīng)元中的研究結(jié)果一致。但在較高CoCl2濃度水平(800 μmol/L)時(shí)，HIF-1α mRNA及蛋白表達(dá)水平均顯著下降，這可能與高濃度CoCl2對(duì)細(xì)胞直接損傷效應(yīng)有關(guān)，這種損傷效用可能與其所誘發(fā)的絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)的活化有關(guān)[4]。

目前研究表明，HIF-1α在缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中起著雙重作用，其發(fā)揮促凋亡或者抑凋亡作用取決于缺氧程度。在輕度缺氧時(shí)，HIF-1α可通過誘導(dǎo)抗凋亡蛋白IAP-2表達(dá)，并抑制促凋亡蛋白Bax表達(dá)從而抑制凋亡[5]；當(dāng)細(xì)胞處于嚴(yán)重缺氧狀態(tài)時(shí)，HIF-1α通過穩(wěn)定p53蛋白促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[6]。本結(jié)果也顯示，在CoCl2≤200 μmol/L時(shí)，PANC1細(xì)胞的凋亡率無顯著變化，同時(shí)伴有HIF-1α 蛋白表達(dá)水平升高，提示HIF-1α可能在輕度缺氧條件下參與了對(duì)細(xì)胞的保護(hù)；而在CoCl2≥400 μmol/L時(shí)，細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組顯著升高，同時(shí)伴有HIF-1α表達(dá)下降，這與之前物理缺氧的研究結(jié)果有所不同[6]，提示CoCl2本身對(duì)細(xì)胞的損傷效應(yīng)可能干擾了其所誘導(dǎo)的缺氧對(duì)細(xì)胞的作用。

最新研究發(fā)現(xiàn)，缺氧在腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移中起著重要作用，其中HIF-1α起著關(guān)鍵的介導(dǎo)作用[7-9]。有研究表明,HIF-1α可通過誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)表達(dá)上調(diào)從而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[7]。研究還表明，缺氧狀態(tài)下HIF-1α可與TGF-β或Notch通路共同作用誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移[8-9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CoCl2模擬缺氧對(duì)PANC1細(xì)胞遷移的作用呈現(xiàn)雙向性，與HIF-1α蛋白表達(dá)的變化趨勢(shì)一致，提示HIF-1α可能與缺氧促胰腺癌PANC1細(xì)胞遷移的作用有關(guān)，但在嚴(yán)重缺氧時(shí)，細(xì)胞遷移率反而降低，同時(shí)HIF-1α蛋白表達(dá)下降，這可能是CoCl2本身對(duì)細(xì)胞損傷效應(yīng)的表現(xiàn)。

[1] Harris AL. Hypoxia-a key regulatory factor in tumour growth. Nat Rev Cancer, 2002, 2:38-47.

[2] Kizaka-Kondoh S, Tanaka S, Harada H, et al. The HIF-1-active microenvironment: an environmental target for cancer therapy. Adv Drug Deliv Rev, 2009, 61:623-632.

[3] Guo S, Bragina O, Xu Y, et al. Glucose up-regulates HIF-1 alpha expression in primary cortical neurons in response to hypoxia through maintaining cellular redox status. J Neurochem, 2008, 105:1849-1860.

[4] Zou W, Zeng J, Zhuo M, et al. Involvement of caspase-3 and p38 mitogen-activated protein kinase in cobalt chloride-induced apoptosis in PC12 cells. J Neurosci Res, 2002, 67:837-843.

[5] Greijer AE, van der Wall E. The role of hypoxia inducible factor 1 (HIF-1) in hypoxia induced apoptosis. J Clin Pathol, 2004, 57: 1009-1014.

[6] Schmid T, Zhou J, Brüne B. HIF-1 and p53: communication of transcription factors under hypoxia. J Cell Mol Med, 2004, 8: 423-431.

[8] Haase VH. Oxygen regulates epithelial-to-mesenchymal transition: insights into molecular mechanisms and relevance to disease. Kidney Int, 2009, 76:492-499.

[9] Jiang J, Tang YL, Liang XH. EMT: a new vision of hypoxia promoting cancer progression. Cancer Biol Ther, 2011,11:714-723.

Effectsofcobaltchloridemimetichypoxiaontheproliferation,apoptosisandmigrationofhumanpancreaticcancercelllinePANC1

ZHULiang,XUSheng-nan,PANGHui-fang,ZHAOHui-zhen,QINHua,LIPei-yuan,LIDe-min,ZHAOQiu.
DepartmentofGastroenterology,TongjiHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030,China

ZHAOQiu,Email:zhaoqiu@medmail.com.cn

ObjectiveTo investigate the influence of cobalt chloride (CoCl2)-mimetic hypoxia on the proliferation, apoptosis and migration of human pancreatic cancer cell line PANC1.MethodsPANC1 cells were treated with 0(control), 100, 200, 400, 800 μmol/L CoCl2respectively for 24 h. Real-time RT-PCR and Western blot were used to determine hypoxia induced factor (HIF)-1α mRNA and protein expression respectively, and cell counting kit-8(CCK-8) assays, flow cytometry and cell scratch test were used to examine the proliferation, apoptosis and migration of PANC1 cells, respectively.ResultsIn the control group and 100, 200, 400 and 800 μmol/L CoCl-2 groups, the expressions of HIF-1α mRNA were 1, 1.08±0.12, 1.12±0.09, 1.04±0.11, 0.66±0.07, and the expressions of VEGF mRNA were 1, 2.69±0.35, 4.81±0.54, 2.19±0.21, 0.79±0.08, while the expressions of HIF-1α protein were 0.23±0.03, 0.36±0.04, 1.15±0.11, 1.08±0.09, 0.44±0.04; and the expressions of VEGF protein were 0.14±0.02, 0.12±0.01, 0.95±0.09, 0.87±0.09, 0.55±0.06; and cell viability rates were 100%, (98.43±2.88)%, (76.15±0.70)%, (53.87±0.77)%, (35.23±0.67)%; while cell apoptotic rates were (5.2±1.12)%, (5.74±1.07)%, (6.82±1.85)%, (12.09±3.53)%, (31.88±6.95)%; the cell migration distance of PANC1 cells were (43.24±3.67)%, (59.46±5.39)%, (80.56±8.05)%, (63.89±5.96)%, (9.09±1.59)%. Compared with those of control group, the expressions of VEGF mRNA, VEGF and HIF-1α protein, cell migration distance showed a two-way variation (ascending first and descending later) (P<0.05), and the expression of HIF-1α mRNA and cell proliferation rate was decreased in a dose-dependent manner, while the cell apoptosis was increased in a dose-dependent manner.ConclusionsCoCl2significantly inhibits the proliferation and promotes apoptosis of PANC1 cells at certain level. CoCl2has a two-way effect on the migration of PANC1 cells, and it may be related to the direct injury of high concentration of CoCl2on cells.

Pancreatic neoplasms; Anoxia; Cobalt chloride; Cell proliferation; Apoptosis; Cell movement

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.02.011

430030 武漢，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院消化內(nèi)科(朱亮、徐勝南、龐慧芳、趙慧貞、覃華、黎培員、李德民、趙秋)；南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科(朱亮)

趙秋，Email: zhaoqiu@medmail.com.cn

2011-11-25)

(本文編輯：呂芳萍)