神經中間絲蛋白NF-66與胰島素瘤良惡性的關系

劉貝 肖雨 朱麗明 喬新偉 向紅丁 陳杰 陳原稼

·論著·

神經中間絲蛋白NF-66與胰島素瘤良惡性的關系

劉貝 肖雨 朱麗明 喬新偉 向紅丁 陳杰 陳原稼

目的探討神經中間絲蛋白NF-66能否作為判斷胰島素瘤良惡性的分子標志物。方法采用免疫組織化學染色法檢測胰島素瘤組織、瘤旁胰腺組織及3株胰島素瘤細胞株NF-66蛋白的表達，應用單因素及多因素統計分析胰島素瘤NF-66蛋白表達與腫瘤病理特征及患者預后的相關性。結果132例胰島素瘤組織中102例(77%)表達NF-66蛋白,98例瘤旁胰腺組織均未見該蛋白表達(P=4.86×10-31)；3株胰島素瘤細胞株均高表達NF-66蛋白。118例良性胰島素瘤中96例(81%)表達NF-66,而14例惡性胰島素瘤中6例(43%)表達NF-66，惡性胰島素瘤的表達顯著下降(P=0.003)。胰島素瘤NF-66表達與腫瘤大小(以3 cm為界)、遠處轉移、遠處并淋巴結轉移均呈顯著負相關(46%比81%,P=0.009；38%比81%,P=0.013；43%比81%,P=0.010)；而與患者性別、年齡、腫瘤復發和生存狀態不相關。結論胰島素瘤中NF-66表達下調與腫瘤的惡性生物學特征有關，可能成為潛在的鑒別胰島素瘤良惡性的分子標志物。

胰島素瘤; 中間絲蛋白質類; 診斷，鑒別; 預后

胰島素瘤是少見的腫瘤,其發生的分子機制尚未闡明[1-3]。臨床上主要根據腫瘤有無淋巴結或遠處轉移以及有無周圍組織、器官侵襲來判斷其良惡性[1-4]。如果惡性胰島素瘤處于早期階段,沒有侵襲或轉移的證據,單純依靠病理形態學無法鑒別,因此探索和發現鑒別胰島素瘤良惡性的分子標志物具有重要臨床意義。我們曾采用差異蛋白組學的方法發現神經中間絲蛋白NF-66在胰島素瘤高表達,而瘤旁組織及正常的胰腺組織中未見表達(結果待發表)。本研究在較大的胰島素瘤樣本和胰島素瘤細胞株中檢測NF-66的表達,探討其作為鑒別胰島素瘤良惡性分子標志物的臨床價值。

材料與方法

一、標本來源及診斷標準

1990至2010年在北京協和醫院就診并手術切除腫瘤的132例胰島素瘤患者作為研究對象,96例瘤旁胰腺組織作為對照。胰島素瘤的診斷標準,參照我們已往發表的文章[5-6]。

二、免疫組織化學法檢測NF-66表達

小鼠抗NF-66(MAB5224)購自美國Chemicon公司,兔抗小鼠IgG/HRP購自北京中杉金橋生物試劑有限公司，工作濃度為1∶600。胞質有棕黃著色者為陽性細胞，陽性細胞數占總細胞>20%為表達陽性。免疫組化的全部結果均經過病理醫師復查。

三、蛋白質印跡法檢測胰島素瘤細胞株NF-66表達

小鼠和大鼠胰島素瘤細胞株RIN-m購自北京欣源佳和科技公司，β-TC3、INS-1由中日友好醫院婁晉寧教授惠贈。置含10%胎牛血清的DMEM或RPMI1640培養基中培養。常規提取細胞株蛋白,行蛋白質印跡法。NF-66一抗的工作濃度為1∶200,β-actin作為內對照。

四、統計學分析

用SPSS16.0統計軟件進行分析。采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗進行單因素分析,用logistic進行多因素分析。P<0.05為差異具有統計學意義。

結 果

一、胰島素瘤患者的臨床資料和腫瘤病理特征

132例胰島素瘤患者中男性54例,女性76例，有2例患者系20年前就診,性別記載不詳；年齡14～74歲，中位年齡44歲。所有患者均為單發。126例有腫瘤部位記載，其中位于胰頭頸部62例,胰體尾部64例；131例有瘤體直徑記載，其中≥3 cm 13例,<3 cm 118例。病理確診良性118例,惡性14例。89例患者獲得隨訪，隨訪2～224個月，隨訪中位數為37.5個月。81例患者無瘤生存，3例患者帶瘤生存(包括2例腫瘤復發者)；3例患者不能明確是帶瘤生存還是無瘤生存；2例患者病死于腫瘤。

二、胰島素瘤組織和瘤細胞株中NF-66表達

胰島素瘤組織NF-66蛋白表達率為77%(102/132),瘤旁胰腺組織均無NF-66蛋白表達(P=4.86×10-31，圖1)。3株胰島素瘤細胞株均高表達NF-66蛋白(圖2)。

圖1胰島素瘤及瘤旁胰腺組織病理改變(a、c)及NF-66蛋白(b、d)表達(免疫組化染色，×100或×200)

圖2 3株胰島素瘤細胞株的NF-66蛋白表達

三、NF-66表達和胰島素瘤臨床病理特征的關系

單因素分析顯示，胰島素瘤NF-66表達與腫瘤大小、良惡性、腫瘤轉移呈顯著負相關，而與患者性別、年齡、腫瘤復發和患者的生存狀態均不相關(表1)。多因素分析顯示，NF-66的表達與腫瘤大小、良惡性、腫瘤轉移仍然呈顯著負相關,與患者預后和腫瘤原發部位呈相關趨勢(表1)。

討 論

胰島素瘤是最常見的胰腺內分泌腫瘤之一,10%～16%為惡性[2,4]。北京協和醫院已收治胰島素瘤患者400例以上,其中惡性腫瘤比例為4.5%[7]。 雖然絕大部分胰島素瘤是良性,但畢竟有些患者因為是惡性而最終病死。由于臨床上缺乏有效的鑒別腫瘤良惡性的手段,在沒有腫瘤轉移和侵襲的證據時,通常把腫瘤診斷為良性。本組有1例患者首次入院時因腫瘤僅1.2 cm，無轉移和侵襲，診斷為良性胰島素瘤。10年后患者再次來院就診,發現肝臟多處轉移瘤,而胰腺未見明顯占位。因此臨床上非常需要鑒別腫瘤良惡性的分子標記物。

表1 NF-66表達與胰島素瘤臨床病理特征的相關性

注：-表示未統計

NF-66是一種分子質量為66000的神經絲蛋白,其在神經系統廣泛表達[8-9],并且和神經分化發育有關。NF-66在神經母細胞瘤中高表達[10]。胰島素瘤是神經內分泌腫瘤中的一員，因此,NF-66在胰島素瘤廣泛表達。本結果顯示，胰島素瘤NF-66蛋白表達率高達77%,在3株鼠源性胰島素瘤細胞株中也強表達。有價值的發現是惡性胰島素瘤的表達率較良性胰島素瘤明顯下降甚至不表達。單因素及多因素分析均顯示胰島素瘤NF-66的表達與腫瘤的良惡性、大小、轉移呈負相關，提示胰島素瘤NF-66蛋白的下調與腫瘤的惡性生物學行為相關，因此有可能作為潛在的鑒別胰島素瘤良惡性的分子標志物。

雖然我們隨訪了絕大多數的患者,且隨訪中位數也達到3年以上，但對于病程進展緩慢的神經內分泌腫瘤而言[3],隨訪的時間仍不夠長,因此本組僅發現2例患者病死,3例患者帶瘤生存。因例數太少(僅5例),目前尚不能推斷該蛋白究竟有無判斷預后的價值。

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Expressionofneuronalintermediatefilamentprotein(NF-66)andrelationshipwithbenignandmalignancyofinsulinomas

LIUBei,XIAOYu,ZHULi-ming,QIAOXin-wei,XIANGHong-ding,CHENJie,CHENYuan-Jia.
DepartmentofGastroenterology,PekingUnionHospital，ChineseAcademyofMedicalSciences&PekingUnionMedicalCollege,Beijing100730,China

CHENYuan-jia,Email:yuanjchen@gmail.com

ObjectiveTo investigate whether neuronal intermediate filament protein(NF-66) could be used as a molecular marker for the determination of malignancy of insulinoma.MethodsThe expression of NF-66 protein was detected in insulinoma and para-cancerous tissues and 3 insulinoma cell lines by immunohistochemistry staining. The relationship between the expression of NF-66 protein and the clinicopathological characteristics, survival was analyzed by univariate and multivariate statistical analysis.ResultsExpression of NF-66 was found in 102(77%) out of 132 insulinomas and none of 98 paired control (P=4.86×10-31). NF-66 was highly expressed in 3 insulinoma cell lines. The expression of NF-66 was found in 96 (81%) out of 118 benign tumors (P=0.003), while out of 14 malignant insulinomas, 6(43%) were found to express NF-66(P=0.003). The expression of NF-66 was significantly associated with tumor size (3 cm as the cut-off point), distant metastasis (38%vs81%,P=0.013) and distant plus lymph node metastasis (46%vs81%,P=0.009), respectively. The expression of NF-66 was not correlated with age, gender, recurrence and overall survival.ConclusionsDown-regulation of NF-66 was significantly associated with tumor malignancy, suggesting that NF-66 could be a potentially novel molecular biomarker to distinguish malignancy from benign insulinoma.

Insulinoma; Intermediate filament proteins; Diagnosis, differential; Prognosis

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.02.005

國家自然科學基金(30850002、8107205)；北京協和醫院衛生部內分泌重點實驗室專項基金

100730 北京，中國醫學科學院 北京協和醫學院 北京協和醫院消化內科(劉貝、朱麗明、喬新偉、陳原稼),病理科(肖雨、陳杰),內分泌科 衛生部內分泌重點實驗室(向紅丁、陳原稼)

陳原稼，Email:yuanjchen@gmail.com

2011-08-21)

(本文編輯：呂芳萍)