氧調節蛋白150在急性壞死性胰腺炎胰腺損傷中的作用

劉壘 鄧文宏 陳辰 李金友 王衛星

·短篇論著·

氧調節蛋白150在急性壞死性胰腺炎胰腺損傷中的作用

劉壘 鄧文宏 陳辰 李金友 王衛星

重癥急性胰腺炎(severe acute pancreastitis, SAP)是臨床常見的急腹癥，病情兇險，病死率高，易伴發全身炎癥反應綜合征(SIRS)，甚至多器官功能不全綜合征(MODS)。氧調節蛋白150(ORP150)是葡萄糖調節蛋白(GRPs)家族的成員。它作為一種應激蛋白，正常情況下表達很低。當細胞和組織暴露于缺氧、缺血-再灌注損傷等應激環境時則能誘發內質網應激，從而使ORP150的表達增高。本研究觀察急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠胰腺組織中ORP150基因的表達，探討其在ANP大鼠胰腺損傷中的作用。

一、材料與方法

1．實驗動物及分組：6～7周齡SPF級雄性Wistar大鼠54只，購自湖北省疾病控制中心，體重200～240 g。按完全隨機法將大鼠分為假手術1、3、6、12 h組，ANP 1、3、6、12 h組和塞來昔布治療1 h組，每個時間點6只大鼠。假手術組大鼠在開腹后僅翻動十二指腸和胰腺即關腹。ANP組經胰膽管逆行注射5%牛磺膽酸鈉1 ml/kg體重(Sigma公司)制模。治療組于造模前30 min經股靜脈注射塞來昔布10 mg/kg體重。所有大鼠術后均皮下注射生理鹽水20 ml/kg體重補液。按各時間點處死大鼠，心臟采血，離心分離血清，保存于-20℃備用，取胰頭組織4%多聚甲醛固定，其余胰腺組織經液氮固定后凍存于-80℃。

2．血清淀粉酶檢測：血清淀粉酶采用全自動生化分析儀測定。

3．胰腺組織病理學檢查：取多聚甲醛固定的胰頭組織，常規脫水、包埋、切片、HE染色。由2位病理科醫師采用雙盲法于光鏡下觀察胰腺組織的病理學改變，并參照Schmidt等[1]標準進行評分。

4．胰腺組織ORP150 mRNA表達檢測： ORP150 (495 bp)引物序列：上游5′-TCTCCTACCACCTCTATTT-3′，下游5′-CAGCACCCTTCCTACA-3′；Actin(207 bp)引物序列：上游5′-CCAACTGGGACGATATGGAG-3′，下游5′-CAGAGGCATACA-GGGACAAC-3′，引物由Invitrogen公司合成。采用RT-PCR檢測ORP150 mRNA表達。取約100 mg胰腺組織，應用Trizol(Invitrogen公司)抽提組織總RNA。應用cDNA逆轉錄試劑盒(TOYOBA公司)逆轉錄成cDNA。應用PCR試劑盒(MBI Fermentas公司)行PCR反應。反應條件： 94℃ 5 min，94℃ 30 s、54℃(ORP150)或56℃(Actin)30 s、72℃ 1 min，35個循環，72℃ 7 min。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳分離、掃描，以ORP150與Actin條帶的灰度比值表示ORP150 mRNA的表達水平。

5．胰腺組織ORP150蛋白表達的檢測：取-80℃保存的胰腺組織50 mg，用冰預冷的0.01 mol/L PBS充分洗滌后，加入適量RIPA蛋白提取液裂解40 min， 4℃離心取上清，常規行蛋白質印跡法檢測ORP150蛋白的表達。兔抗大鼠ORP150一抗(Santa Cruz公司)工作濃度1∶3000，HRP-山羊抗兔IgG(Pierce公司)工作濃度1∶1000。最后ECL(Santa Cruz公司)發光，X線底片曝光、顯影。以ORP150條帶與內參條帶的灰度比值表示ORP150蛋白表達水平。

二、結果

1．血清淀粉酶變化：假手術1、3、6、12 h組，ANP 1、3、6、12 h組和塞來昔布治療1 h組大鼠的血清淀粉酶活性分別為(930±117)、(945±110)、(1047±176)、(1061±148)、(2649±374)、(3562±286)、(4166±402)、(5549±637)、(1523±65)U/L，ANP組較假手術組明顯升高，且隨時間延長而逐漸升高，治療組較ANP 1 h組顯著降低，但仍顯著高于假手術組，差異均具有統計學意義(P值均<0.05)。

2．胰腺組織病理變化：假手術組大鼠的胰腺組織未見明顯病理改變；ANP組大鼠胰腺可見不同程度的水腫、出血及片狀壞死，腺葉間隙增寬，炎性細胞浸潤等，且隨病程延長逐漸加重；治療1 h組大鼠胰腺的損傷較ANP 1 h組有所減輕(圖1)。假手術1、3、6、12 h組，ANP 1、3、6、12 h組和塞來昔布治療1 h組大鼠的胰腺病理評分分別為(0.18±0.02)、(0.22±0.02)、(0.26±0.41)、(0.35±0.27)、(5.15±0.56)、(7.69±0.63)、(9.81±0.57)、(11.30±1.70)、(3.23±0.31)分，ANP組較假手術組明顯升高，且隨時間延長而逐漸升高，治療組較ANP 1 h組顯著降低，但仍顯著高于假手術組，差異均具有統計學意義(P值均<0.05)。

3．胰腺組織ORP150 mRNA及蛋白表達的變化：假手術1 h組，ANP 1、3、6、12 h組和塞來昔布治療1 h組大鼠胰腺組織ORP150 mRNA表達量分別為0.058、0.589、0.097、0.093、0.044和1.338；ORP150蛋白表達量分別為0.040、1.645、1.605、0.490、0.174和2.250(圖2、3)。ANP 1 h組的ORP150 mRNA及蛋白表達最高，隨著時間延長表達逐漸降低，除12 h點mRNA表達量外，其他各組均顯著高于假手術組，塞來昔布治療1 h組的表達量又較ANP 1 h組顯著升高，各組間差異具有統計學意義(P值均<0.05)。

圖1假手術 1 h組(a)，ANP 1、3、6、12 h組(b～e)和塞來昔布治療1h組(f)大鼠的胰腺病理變化(HE ×200)

圖2 各組胰腺組織ORP150 mRNA的表達

圖3 各組胰腺組織ORP150蛋白表達

討論氧化應激是機體內活性氧(ROS)和活性氮(RNS)大量生成及抗氧化物質失衡狀態下，直接或間接通過信號轉導通路引起的細胞損傷[2]。很多危重疾病，如膿毒血癥、燒傷、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)、艾滋病(AIDS)等都會出現ROS、RNS的增加和抗氧化能力下降[3]。氧化應激在急性胰腺炎(AP)胰腺損傷、局部或全身并發癥中亦起著至關重要的作用[4-7]。氧自由基直接參與了AP相關的MODS中的細胞損傷和細胞內信號途徑的調節，同時亦參與了AP時白細胞的激活、NF-κB活化引起的炎性細胞因子的表達、微循環障礙等過程[8]。

ORP150是一類存在于內質網的蛋白質，廣泛分布于肝臟、腦、胰腺、肺等組織[9]。它與其他葡萄糖調節蛋白一起應對各種應激環境。當機體處于應激環境時，ORP150高表達，與受損或者新合成的蛋白質短暫性地結合，防止其形成二聚體和蛋白質構象的錯誤折疊[10-13]。ORP150作為內質網的分子伴侶，在很多疾病的發病過程中均發揮著保護作用。有研究報道，ORP150能抑制缺氧導致的細胞凋亡，對缺氧情況下的腦組織和心肌細胞的凋亡有保護作用。抑制ORP150在腦星形細胞的表達會加快細胞的缺氧死亡，而刺激體外培養的神經元ORP150表達則能阻止腦細胞的缺氧性死亡。此外，ORP150的表達能加快皮膚傷口愈合，改善大鼠缺血性骨壞死[14-18]。

本研究結果顯示，ANP大鼠胰腺組織ORP150基因表達在制模后1 h即迅速升高，然后逐漸下降，推測ORP150可能通過內質網應激參與了ANP的發病過程。但ORP150在ANP大鼠胰腺損傷中發揮作用的具體機制目前尚不清楚，有待于進一步研究。

國外有體外實驗證實塞來昔布能夠上調組織中的ORP150表達水平[19]。因此，本研究選用塞來昔布作為干預手段來觀察ANP大鼠胰腺組織ORP150表達水平的變化。結果顯示，在制模前1 h給予塞來昔布干預，胰腺組織中的ORP150 mRNA和蛋白的表達水平較ANP 1 h組確實升高，胰腺組織病理損傷減輕，胰腺病理學評分及血清淀粉酶水平均降低，提示ORP150表達水平的提高在ANP的胰腺損傷中發揮了保護作用。

[1] Schmidt J, Lewandrowsi K, Warshaw AL, et al. Morphometric characteristics and homogeneity of a new model of acute pancreatitis in the rat. Int J Pancreatol, 1992, 12: 41-51.

[2] Dryden GW Jr, Deaciuc I, Arteel G, et al. Clinical implications of oxidative stress and antioxidant therapy. Curr Gastroenterol Rep, 2005, 7:308-316.

[3] Roth E, Manhart N, Wessner B. Assessing the antioxidative status in critically ill patients. Curr Opin Nutr Metab Care, 2004, 7:161-168.

[4] Thareja S, Bhardwaj P, Sateesh J, et al.Variations in the levels of oxidative stress and antioxidants during early acute pancreatitis. Trop Gastroenterol, 2009, 30: 26-31.

[5] 王艷紅,馮志杰,郝曉.急性胰腺炎與氧化應激.世界華人消化雜志,2007,15: 1266-1272.

[6] Leung PS, Chan YC. Role of oxidative stress in pancreatic inflammation. Antioxid Redox Signal, 2009,11:135-165.

[7] 楊成林, 張樹友. 氧化應激與急性胰腺炎治療相關的研究進展. 醫學綜述, 2004, 13:519-521.

[8] Esrefoglu M, Gül M, Ates B, et al. Antioxidative effect of melatonin, ascorbic acid and N-acetylcysteine on caerulein-induced pancreatitis and associated liver injury rats. World J Gastroenterol, 2006, 12:259-264.

[9] Kobayashi T, Ohta Y. Enforced expression of oxygen-regulated protein, ORP150, induces vacuolar degeneration in mouse myocardium. Transgenic Res, 2003, 12:13-22.

[10] Kuznetsov G, Chen LB, Nigam SK. Several endoplasmic reticulum stress proteins, including ERp72, interact with thyroglobulin during its maturation. J Biol Chem, 1994, 269:22990-22995.

[11] Toledo H, Carlino A, Vidal V, et al. Dissociation of glucose-regulated protein Grp78 and Grp78-IgE Fc complexes by ATP. Proc Natl Acad Sci USA, 1993, 90: 2505-2508.

[12] Ni M, Lee AS. ER chaperones in mammalian development and human diseases. FEBS Lett, 2007,581:3641-3651.

[13] Ron D, Walter P. Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response. Nat Rev Mol Cell Biol, 2007,8:519-529.

[14] Ozawa K, Kuwabara K, Tamatani M, et al.150-kDa oxygen-regulated protein (ORP150)suppresses hypoxia-induced apoptotic cell death. J Biol Chem, 1999, 274:6397-6404.

[15] Tamatani M, Matsuyama T, Yamaguchi A, et al. ORP150 protects against hypoxia/ischemia-induced neuronal death. Nat Med, 2001,7:317-323.

[16] Aleshin AN, Sawa Y, Kitagawa-Sakakida S, et al.150-kDa oxygen-regulated protein attenuates myocardial ischemia-reperfusion injury in rat heart. J Mol Cell Cardiol, 2005, 38:517-525.

[17] Ishida Y, Kimura A, Takayasu T, et al. Expression of oxygen-regulated protein 150 (ORP150) in skin wound healing and its application for wound age determination. Int J Legal Med, 2008, 122:409-414.

[18] Sato M, Sugano N, Ohzono K, et al. Apoptosis and expression of stress protein(ORP150, HO1) during development of ischaemic osteonecrosis in the rat. J Bone Joint Surg Br, 2001, 83:751-759.

[19] Namba T, Hoshino T, Tanaka K. Up-regulation of 150-kDa oxygen-regulated protein by celecoxib in human gastric carcinoma cells. Mol Pharmacol, 2007, 71:860-870.

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.04.017

武漢大學2008年博士研究生(含1+4)自主科研項目(20083020101000061);國家自然科學基金面上項目(81070368);中央高校基本科研業務費專項資金(4104003)

430060 湖北，武漢大學人民醫院普通外科

王衛星，Email：sate.llite@163.com

2010-06-17)

(本文編輯：呂芳萍)