胰腺癌及相關胰腺疾病組織中K-ras12、13密碼子突變的檢測及其臨床診斷價值

朱艷平 李泉江 高軍 顧俊俊 黃浩杰 李兆申

·論著·

胰腺癌及相關胰腺疾病組織中K-ras12、13密碼子突變的檢測及其臨床診斷價值

朱艷平 李泉江 高軍 顧俊俊 黃浩杰 李兆申

目的研究K-ras基因第12、13位密碼子突變在胰腺導管腺癌及相關胰腺疾病組織中的定量檢測及其臨床意義。方法收集經手術切除的130例(胰腺導管腺癌105例，胰腺腺鱗癌8例，胰腺黏液腺癌2例，內分泌癌3例，十二指腸及壺腹部惡性腫瘤6例，胰腺良性疾病6例)有明確病理診斷的組織標本及臨床資料，應用雙熒光探針聯合肽核酸鉗制實時定量PCR方法檢測組織中K-ras基因第12、13密碼子的突變量，以突變量>100拷貝為陽性計算突變陽性率。結果胰腺導管腺癌、腺鱗癌、黏液腺癌、內分泌癌、十二指腸及壺腹部惡性腫瘤、胰腺良性疾病的K-ras12密碼子突變量的中位數及四分位數分別為4062(495，10800)、238(45,8420)、15(9,21)、3(3,16)、2283(73,5037)和21(8,56)；突變陽性率分別為84.8%(89/105)、50.0%(4/8)、0、0、66.7%(4/6)和16.7%(1/6)。胰腺導管腺癌的K-ras 12密碼子突變量及陽性率與胰腺腺鱗癌、十二指腸及壺腹部惡性腫瘤差異無統計學意義，而較胰腺黏液腺癌、內分泌癌、胰腺良性疾病顯著增加(P值均<0.05)。通過接受者操作特征(ROC)曲線分析，胰腺導管腺癌K-ras 12密碼子突變的曲線下面積為0.727，診斷胰腺導管腺癌的敏感性及特異性分別為84.8%、64.0%。胰腺導管腺癌的K-ras基因第12密碼子突變量與患者生存期顯著相關。胰腺導管腺癌的K-ras 13密碼子突變量及陽性率與其他胰腺疾病的差異無統計學意義。結論K-ras12密碼子基因突變對胰腺癌有較好的鑒別診斷及患者預后判斷價值。

胰腺腫瘤； K-ras基因； 密碼子； 點突變； 診斷

材料與方法

一、材料

收集2006年8月至2010年4月我院手術治療的胰腺疾病相關患者130例。其中男性82例，女性48例，年齡30～80歲，平均(59±9)歲，中位年齡60歲。所有患者臨床資料完整，術前均未進行化療和放療。所有病例均通過手術切除標本、活檢或穿刺組織標本的病理學檢查確診；病理檢查未見癌細胞，經18～29個月隨訪證實無癌變，確診為良性病變。

二、K-ras突變的定量檢測

取約50 mg組織，采用酚-氯仿提取法抽提組織DNA。使用NanoDrop核酸微量測量儀(ND1000型)測定DNA樣本濃度，根據A260/A280比值判定其純度。采用肽核酸鉗制實時熒光定量PCR法檢測K-ras 12、13密碼子突變量。K-ras 突變量為125 ng DNA中檢測的突變拷貝數，突變量>100拷貝為K-ras突變陽性，K-ras突變陽性率=K-ras突變陽性例數/總檢測例數。

三、資料分析與統計

采用SPSS16.0統計軟件進行統計分析。突變量呈偏態分布，用中位數及四分位數表示。兩組間突變量的比較采用Mann-WhitneyU檢驗。通過接受者操作特征(ROC)曲線下面積(AUC)判斷陽性截止值。P<0.05為差異具有統計學意義。

結 果

一、胰腺組織病理診斷

130例組織中胰腺導管腺癌105例，胰腺腺鱗癌8例，胰腺黏液腺癌2例，內分泌癌3例，十二指腸及壺腹部惡性腫瘤6例，胰腺良性疾病6例。

二、各種胰腺疾病K-ras 12、13密碼子突變量

胰腺導管腺癌、腺鱗癌、黏液腺癌、內分泌癌、十二指腸及壺腹部惡性腫瘤、胰腺良性疾病的K-ras12密碼子突變量的中位數及四分位數分別為4062(495，10800)、238(45,8420)、15(9,21)、3(3,16)、2283(73,5037)和21(8,56)；突變陽性率分別為84.8%(89/105)、50.0%(4/8)、0、0、66.7%(4/6)和16.7%(1/6)。胰腺導管腺癌的K-ras 12密碼子突變量和突變陽性率與胰腺腺鱗癌、十二指腸及壺腹部惡性腫瘤比較，差異無統計學意義(P值均>0.05)，而較胰腺黏液腺癌、內分泌癌、胰腺良性疾病的突變量及突變陽性率顯著增加，差異具有統計學意義(P值分別為0.04、0.00、0.02)。

37例胰腺導管腺癌、7例胰腺腺鱗癌、2例胰腺黏液腺癌、3例內分泌癌、6例十二指腸及壺腹部惡性腫瘤、6例胰腺良性疾病檢測了K-ras 13密碼子突變量。其中位數及四分位數分別為9(0,245)、14(0,140)、414(1,827)、3(2,4)、370(0,598)和6(4,106)；突變陽性率分別為40.5%(15/37)、28.6%(2/7)、50.0%(1/2)、0、66.7%(4/6)和33.3%(2/6)。胰腺導管腺癌的K-ras 13密碼子突變量和突變陽性率與其他5種疾病比較差異均無統計學意義(P值均>0.05)。

三、K-ras 12、13密碼子突變量的ROC分析

胰腺導管腺癌、腺鱗癌、黏液腺癌、內分泌癌、十二指腸及壺腹部惡性腫瘤、胰腺良性疾病的K-ras12密碼子突變的AUC分別為0.727、0.651、0.962、0.946、0.700和0.784。胰腺導管腺癌的K-ras 12密碼子突變的AUC與胰腺腺鱗癌、十二指腸及壺腹部惡性腫瘤比較，差異無統計學意義(P值分別為0.155、0.100)，而較胰腺黏液腺癌、內分泌癌、胰腺良性疾病的AUC顯著減少，差異具有統計學意義(P值分別為0.026、0.009、0.020)。

以K-ras12密碼子突變量100拷貝為陽性截止值時，診斷胰腺導管腺癌的敏感性為84.8%，特異性為64.0%，陽性預測值為90.8%，陰性預測值為50.0%，約登指數為0.488。

胰腺導管腺癌、腺鱗癌、黏液腺癌、內分泌癌、十二指腸及壺腹部惡性腫瘤、胰腺良性疾病的K-ras13密碼子突變的AUC分別為0.563、0.544、0.027、0.568、0.335和0.495。胰腺導管腺癌與其他5種疾病的差異均無統計學意義(P值分別為0.712、0.110、0.750、0.236、0.972)。

四、K-ras 12、13密碼子突變量及突變陽性率與胰腺導管腺癌臨床病理特征間的關系

K-ras 12、13密碼子突變量及突變陽性率與患者年齡、性別、飲酒及腫瘤大小、部位、分化程度、淋巴結轉移、臨床分期、CEA和CA19-9水平等臨床病理參數均無相關性。K-ras基因13密碼子突變量及突變陽性率與患者吸煙、飲酒有關(P值均<0.05，表1)。

五、胰腺導管腺癌中K-ras基因突變與患者生存期的關系

以K-ras12 密碼子突變量>100拷貝為陽性，則突變陽性患者的中位生存期為285 d(95%CI206.6～363.0)；陰性患者的中位生存期為573 d(95%CI322.4～823.5)，兩組差異無統計學意義(P=0.081)。以K-ras12 密碼子突變量>9500拷貝為高突變量組，則高突變量患者的中位生存期為224 d(95%CI180.5～267.5)，低突變量患者的中位生存期為398 d(95%CI329.1～466.9)，高突變量患者的生存期較低突變量患者顯著縮短(P=0.03)。

表1 K-ras 12、13密碼子突變量及突變陽性率與胰腺導管腺癌臨床病理特征的關系

以K-ras13 密碼子突變量>100拷貝為陽性，則突變陽性患者的中位生存期為285 d；陰性患者的中位生存期為254 d(95%CI322.4～823.5)，兩組差異無統計學意義(P=0.70)。以K-ras13 密碼子突變量>140拷貝為高突變量組，則高突變量患者的中位生存期為285 d(95%CI180.5～267.5)，低突變量患者的中位生存期為254 d(95%CI329.1～466.9)，兩組差異無統計學意義(P=0.70)。

討 論

K-ras基因突變的檢測方法多樣，傳統的DNA直接測序法可檢出10%的K-ras突變，常用的PCR-RFLP方法僅能檢出0.5%～5%的K-ras突變，擴增受阻突變體系法(RMS)能測出約1%左右的K-ras突變[5]。近年來出現的PCR酶聯分析、高分辨率溶解分析等方法不僅能夠檢測到K-ras基因的突變，并且能夠進行半定量，但存在耗時較長、操作較繁瑣、結果不穩定、假陽性高等不足之處。本研究采用雙熒光標記探針聯合肽核酸鉗制實時定量PCR法檢測K-ras基因12、13密碼子點突變量，較之以前的以終點法進行定量的PCR技術具有操作簡便、快速高效、在同一反應體系中同時對多個靶基因分子進行擴增、敏感性和特異性高、不易受污染等長處，而且由于應用了熒光探針，可以直接探測PCR擴增過程中熒光信號的變化。

K-ras 基因突變可見于胰腺癌、胰腺癌前病變、慢性胰腺炎等組織[6]。文獻報道，在胰腺癌與胰腺非惡性疾病(包括慢性胰腺炎、胰腺乳頭狀黏液瘤等)患者的組織或胰液中，K-ras的突變量存在明顯差異[7-9]，在慢性胰腺炎及胰腺乳頭狀黏液瘤患者中檢測到K-ras基因的異常提示其惡變傾向性更高[10]。Tada等[11]采用K-ras突變定量方法檢測胰腺癌與胰腺良性疾病,結果顯示胰腺癌的K-ras突變量高于胰腺良性病變。本研究結果顯示，胰腺導管腺癌的K-ras 12密碼子突變量高于胰腺良性病變，與文獻報道的結果一致。但胰腺導管腺癌與胰腺腺鱗癌、十二指腸及壺腹部惡性腫瘤的K-ras 12密碼子突變量的差異無統計學意義，而與胰腺黏液腺癌、內分泌癌的突變量的差異有統計學意義，這種現象尚需加大樣本量進一步驗證。

本研究結果顯示，K-ras 12密碼子突變量與患者年齡、性別、飲酒及腫瘤大小、部位、分化程度、淋巴結轉移、臨床分期等臨床病理特征均無明顯相關性，提示K-ras 12密碼子突變是胰腺導管腺癌發生的早期分子事件。本研究結果還顯示，K-ras 12密碼子突變與胰腺導管腺癌患者的生存期相關，是提示患者預后的潛在指標。但K-ras 13 密碼子的突變對胰腺癌的鑒別診斷及預后價值不大。

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SignificanceofquantitativelydetectingK-rascodon12and13mutationsinthetissuesofpancreaticcancerandrelatedpancreaticdiseases

ZHUYan-ping,LIQuan-jiang,GAOJun,GUJun-jun,HUANGHao-jie,LIZhao-shen.

DepartmentofGastroenterology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

ObjectiveTo investigate the clinical significance of quantitative detection of K-ras codon 12 and 13 mutations in the tissues of pancreatic cancer and related pancreatic diseases.MethodsOne hundred and thirty samples from surgically removed pancreatic tissue with a conclusive pathological diagnosis (105 cases of pancreatic ductal adenocarcinoma, 8 cases of pancreatic adenosquamous carcinoma of the pancreas, 2 cases of pancreatic mucinous adenocarcinoma, 3 cases of pancreatic endocrine carcinoma, 6 cases of duodenal and papillary adenocarcinoma and 6 cases of benign pancreatic diseases) were collected. Quantitative detection of K-ras codon 12 and 13 mutations was performed by the method of peptide nucleic acid-mediated PCR clamping with two different fluorescence labeled probes. Mutation number >100 copies was used as the criteria to calculate the positive mutation rate.ResultsThe median and quartile of K-ras codon 12 mutations of pancreatic ductal adenocarcinoma, adenosquamous carcinoma of the pancreas, pancreatic mucinous adenocarcinoma, pancreatic endocrine carcinoma, duodenal and papillary adenocarcinoma and benign pancreatic diseases were 4062 (495, 10800), 238 (45, 8420), 15 (9, 21), 3 (3, 16), 2283 (73, 5037) and 21(8, 56), and the positive mutation rates were 84.8% (89/105),50.0% (4/8), 0, 0, 66.7% (4/6) and 16.7% (1/6). The quantity of K-ras codon 12 mutation in pancreatic ductal adenocarcinoma was not statistically different from those of adenosquamous carcinoma, duodenal and papillary adenocarcinoma, but it was significantly higher than those in pancreatic mucinous adenocarcinoma, pancreatic endocrine carcinoma, and benign pancreatic diseases (P<0.05). The area under ROC of K-ras codon 12 mutation in pancreatic ductal adenocarcinoma was 0.727. The sensitivity and specificity of the K-ras codon 12 mutation for the diagnosis of pancreatic ductal adenocarcinoma were 84.8%, 64.0%, respectively. The quantity of K-ras codon 12 was associated with survival of patients with pancreatic ductal adenocarcinoma. The quantity of K-ras codon 13 mutations and the positive mutation rates in pancreatic ductal adenocarcinoma was not statistically different from other pancreatic diseases.ConclusionsThe quantity of K-ras codon 12 mutation has good differential diagnostic and prognostic prediction value for pancreatic ductal adenocarcinoma.

Pancreatic neoplasms; K-ras gene; Codon; Point mutation; Diagnosis

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.04.009

國家自然科學基金(30910103911)；上海市重點科技攻關項目(11441901800)

200433 上海，第二軍醫大學長海醫院消化內科

多項研究表明，胰腺癌的發生與K-ras基因突變密切相關[1]。K-ras突變多表現為12密碼子的點突變，其次為13密碼子點突變。但K-ras基因第12密碼子點突變在部分胰腺外分泌良性腫瘤、慢性胰腺炎及胰腺非典型性增生組織中也可檢測到[2]。文獻報道，K-ras突變診斷胰腺癌的敏感性為0～100%，特異性為58%～100%。我科實驗室前期已通過肽核酸鉗制實時熒光定量PCR法檢測K-ras 12、13密碼子的突變[3-4]，本研究旨在驗證其臨床診斷價值，并評價其對判斷患者預后的指導意義。

2012-05-07)

(本文編輯：屠振興)