急性壞死性胰腺炎大鼠甲狀腺濾泡旁細胞功能和超微結構的變化

楊波 劉黎明 鄧文宏 陳辰 余佳 金浩 王衛星

·論著·

急性壞死性胰腺炎大鼠甲狀腺濾泡旁細胞功能和超微結構的變化

楊波 劉黎明 鄧文宏 陳辰 余佳 金浩 王衛星

目的觀察急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠甲狀腺濾泡旁細胞超微結構和功能的變化，探討ANP并發低鈣血癥的可能機制。方法雄性Wistar大鼠32只，按數字表法隨機分為假手術組(SO組)及ANP 3、6、12 h組。采用膽胰管逆行注射5%?；悄懰徕c溶液制備ANP模型。檢測血淀粉酶、脂肪酶、降鈣素及Ca2+水平。取胰腺組織常規病理檢查，取甲狀腺腺葉組織電鏡下觀察濾泡旁細胞超微結構改變。結果ANP組6 h的血淀粉酶、 脂肪酶、降鈣素水平分別為(4025±579)U/L、(8272±794)U/L、(383.6±64.5)pg/ml，均顯著高于SO組的(1063±129)U/L、(55±18)U/L、(143.1±42.2)pg/ml；血清Ca2+水平為(2.41±0.12 )mmol/L ，顯著低于SO組的(2.97±0.12)mmol/L(P值<0.05或<0.01)。ANP組12 h的血清降鈣素水平為(317.1±78.2)pg/ml，較6 h時顯著降低(P<0.01)。ANP組大鼠甲狀腺濾泡旁細胞核膜內陷，線粒體、游離核糖體增生，粗面內質網、高爾基體融合，分泌顆粒增多；6 h后細胞器開始減少并消失，僅余少量分泌顆粒。結論ANP大鼠的甲狀腺濾泡旁細胞結構和功能發生改變，從而導致低鈣血癥的發生。

胰腺炎，急性壞死性； 甲狀腺濾泡旁細胞； 透射電子顯微鏡檢查

重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)常并發一個或多個臟器功能障礙，且常伴有嚴重的代謝功能紊亂，包括低鈣血癥等[1]。甲狀腺濾泡旁細胞能夠產生降鈣素原，并分泌有激素活性的降鈣素，從而調節血清Ca2+水平[2]。目前對SAP患者血鈣降低的機制尚不明確。本研究建立急性壞死性胰腺炎(ANP)模型，觀察甲狀腺濾泡旁細胞形態學及功能的變化，探討其與低鈣血癥之間的相關性。

材料與方法

一、動物分組及模型制備

SPF級雄性Wistar大鼠32只由湖北省疾病預防控制中心提供，體重200～250 g，按數字表法隨機分為假手術組(SO組)及ANP 3、6、12 h組，每組8只。參照Aho等[3]的方法，于膽胰管逆行注射5%?；悄懰徕c(美國Sigma公司)溶液1 ml/kg體重，制備ANP模型。SO組開腹僅翻動十二指腸及胰腺后逐層關腹。造模后3、6、12 h心臟穿刺取血，離心分離血清；取胰腺組織，甲醛固定；取雙側甲狀腺組織，以2.5%戊二醛固定。SO組于0、3、6、12 h各抽2只取標本，結果以總的均值表示。

二、血淀粉酶、脂肪酶、降鈣素和Ca2+水平檢測

血淀粉酶、脂肪酶和Ca2+水平由武漢大學人民醫院檢驗科全自動生化分析儀測定。血清降鈣素水平由武漢大學人民醫院核醫學科采用放射免疫法測定，試劑盒購自北京科美生物技術有限公司。

三、胰腺病理檢查

取固定的胰腺組織，常規包埋、切片、HE染色。由病理科醫師盲法讀片，按Schmidt等[4]標準評分。

四、甲狀腺組織電鏡檢查

戊二醛固定的甲狀腺組織再經1%鋨酸固定、梯度乙醇-丙酮脫水、包埋、超薄切片、醋酸雙氧鈾-枸櫞酸鉛染色，最后在日立H-300型透射電鏡下觀察并攝片。

五、統計學處理

結 果

一、大鼠血淀粉酶、脂肪酶、降鈣素、Ca2+及胰腺組織病理變化

ANP組大鼠血淀粉酶、脂肪酶、降鈣素水平均較SO組顯著升高，但ANP組12 h的血降鈣素水平較6 h時降低。ANP組大鼠血Ca2+水平較SO組顯著下降(表1)。SO組胰腺組織未見病理改變；ANP組胰腺組織可見腺泡破壞，組織水腫、壞死，間質充血、炎性細胞浸潤，且隨時間延長呈進行性加重，病理評分逐漸升高(表1)。

表1 各組大鼠血清淀粉酶、脂肪酶水平及胰腺病理評分變化

注：與SO組比較,a：t值3.049～23.844，P值均<0.01；與ANP組3 h組比較,b:t值2.324～8.158，P值<0.05或<0.01；與ANP 6 h組比較，c:t值2.506～3.832，P值均<0.01

二、甲狀腺濾泡旁細胞超微結構改變

SO組大鼠甲狀腺濾泡旁細胞胞核呈圓形或類圓形，胞質內含電子密度較低的分泌顆粒，線粒體較少、呈梭形，高爾基復合體及粗面內質網較發達，并可見大量游離的核糖體。與周圍的濾泡上皮細胞之間存在著緊密連接(圖1a)。ANP組3 h時大鼠甲狀腺濾泡旁細胞核膜內陷，胞質內線粒體、游離核糖體大量增生(圖1b)，粗面內質網、高爾基體融合，并產生大量低電子密度顆粒(圖1c)，細胞間出現間隙連接，間質毛細血管灌注不足(圖1d)；6 h時胞質內細胞器開始減少，胞質內微管、微絲及中性纖維增生，細胞外基質膠原纖維增生(圖1e)；12 h時細胞核皺縮，胞質內細胞器消失(圖1f)，僅存少量分泌顆粒，與相鄰細胞的連接消失。

討 論

甲狀腺濾泡旁細胞起源于神經嵴，能夠攝取胺前體并對其進行脫羧產生降鈣素原，并分泌具有生物活性的降鈣素，與甲狀旁腺素一起維持機體的血鈣平衡。Kimmel等[5]報道，低鈣血癥在急性胰腺炎(AP)貓的發病率約為50%～70%，其血鈣下降的程度與胰腺炎的預后密切相關。目前，對于AP時低鈣血癥發生的機制尚未完全清楚，主要存在以下5種理論[6]：(1)皂化理論；(2)低白蛋白血癥理論；(3)內環境激素調節理論；(4)游離脂肪酸理論；(5)組織細胞膜通透性改變。

圖1SO組(a)及ANP組3(b、c、d)、6(e)、12(f) h大鼠甲狀腺濾泡旁細胞的超微結構變化(a、f×8000；b×10000；c、d、e×12000)

本實驗結果顯示，ANP組大鼠血清降鈣素水平高于SO組。電鏡觀察到甲狀腺濾泡的毛細血管灌注不足，旁細胞的胞核皺縮，胞質內細胞器消失，線粒體、游離核糖體大量增生，粗面內質網、高爾基體融合，并產生及分泌大量低電子密度顆粒。

能夠引起降鈣素分泌增加的原因很多，包括外周血血鈣濃度的反饋調節、血清維生素D水平以及胃泌素、胰高血糖素等的分泌調節。Stumpf等[7]證實，甲狀腺濾泡旁細胞具有1，25-(OH)3D受體。外周血游離維生素D可直接作用于濾泡旁細胞，增加降鈣素的分泌。我們前期的研究[8]發現，SAP患者血清維生素D結合蛋白水平明顯下降，游離形式的維生素D水平升高，從而作用于濾泡旁細胞表面1，25-(OH)3D受體，增加降鈣素的分泌。另有研究[9-10]發現，在AP初期胃泌素和胰高血糖素分泌量明顯增加。我們推測，在SAP時，機體同樣可以通過增加胃泌素和胰高血糖素的分泌促進降鈣素的分泌。此外，SAP時大量細胞因子釋放入血，可以上調鈣敏感受體基因(CASR基因)的表達[11]，激活磷脂酶C，使非特異性離子通道開放，Ca2+內流，細胞膜去極化，并開放L型Ca2+通道，激發降鈣素的分泌。同時，CASR基因抑制甲狀旁腺細胞增生和甲狀旁腺素的表達，導致甲狀旁腺素分泌減少，可引起機體的低鈣血癥[12]。

本研究結果顯示，6 h后血清降鈣素水平有所下降，其可能的原因為：(1)胃泌素、胰高血糖素等只是在AP初期分泌量增加[6]，6 h后對降鈣素的促分泌作用減弱。(2)6 h左右甲狀腺濾泡的微循環灌注不足，導致旁細胞對外周血細胞因子和激素的敏感性降低，從而降鈣素分泌量減少。(3)6 h后細胞開始出現凋亡，胞質內細胞器減少或消失，從而影響旁細胞對激素的合成和分泌功能。

因此，ANP時甲狀腺濾泡旁細胞結構和功能發生的變化是導致AP低鈣血癥的一個重要原因，但胰腺炎時甲狀腺濾泡旁細胞與甲狀旁腺功能之間的關系有待進一步研究。

[1] 中華醫學會外科學分會胰腺外科學組. 重癥急性胰腺炎診治指南. 中華外科雜志, 2007, 45: 727-729.

[2] 吳熙,于學忠.降鈣素原.中國醫學科學院學報,2008,30:231-235.

[3] Aho HJ,Koskensalo SM,Nevalainen TJ.Experimental pancrea-titisin the rat.Sodium taurocholate-induced acute haemorrhagic pancreatitis.Scand J Gastroenterol,1980,15:411-416.

[4] Schmidt J,Rattner DW,Lewandrowski K,et al.A better model of acute pancreatitis for evaluating therapy.Ann Surg,1992,215:44-56.

[5] Kimmel SE, Washabau RJ, Drobatz KJ. Incidence and prognostic value of low plasma ionized calcium concentration in cats with acute pancreatitis: 46 cases (1996-1998). J Am Vet Med Assoc, 2001，219: 1105-1109.

[6] 黃鶴光. 急性胰腺炎低鈣血癥的機制研究. 胰腺病學, 2003, 3: 183-185.

[7] Stumpf WE, O′Brien LP. Autoradiographic studies with 3H 1,25 dihydroxyvitamin D3 in thyroid and associated tissues of the neck region. Histochemistry, 1987, 87: 53-58.

[8] Jin H, Yu J, Wang W, et al. Serum Gc-globulin levels are reduced in patients with severe acute pancreatitis. Eur J Gastroenterol Hepatol, 201224:501-505.

[9] 李永渝,高占峰,兌丹華，等.粉防己堿、清胰湯對重癥急性胰腺炎豬血胃泌素、胃動素的影響.胰腺病學,2004,4: 5-9.

[10] Taqnjoh K, Tomita R, Ishikawa Y, et al. Changes in glucagon kinetics and processing in patients with acute pancreatitis. Hepato-gastroenterology, 2007, 54: 1250-1255.

[11] Canaff L, Hendy GN. Calcium-sensing receptor gene transcription is up-regulated by the proinflammatory cytokine, interleukin-1beta. Role of the NF-kappaB PATHWAY and kappaB elements. J Biol Chem, 2005, 280: 14177-14188.

[12] Fukumoto S. Basic and clinical aspects of calcimimetics. Structure and function of calcium-sensing receptor. Clin Calcium, 2008, 18: 32-36.

Ultrastructuralandfunctionalchangesofthyroidparafollicularcellinratswithacutenecrotizingpancreatitis

YANGBo,LIULi-ming,DENGWen-hong,CHENChen,YUJia,JINHao,WANGWei-xing.

DepartmentofGeneralSurgery,Peoples′Hospital,WuhanUniversity,Wuhan430060,China

Correspondingauthor:WANGWei-xing,Email:sate.llite@163.com

ObjectiveTo investigate the ultrastructure and function changes of the thyroid parafollicular cell in ANP rats and to study the possible mechanism of hypocalcemia during ANP.MethodsThirty-two male Wistar rats were randomly divided into 4 groups: sham operation group (SO group) and ANP 3, 6, 12 h groups. ANP model was induced by retrograde injection of 5% sodium taurocholate into the biliopancreatic duct. The serum levels of amylase, lipoidase, calcitonin and Ca2+were measured. The pathological changes in pancreatic tissue were observed. The ultrastructure changes of thyroid parafollicular cell were observed.ResultsThe serum levels of amylase, lipoidase, calcitonin and Ca2+were (4025±579)U/L, (8272±794)U/L, (383.6±64.5)pg/ml, (2.41±0.12)mmol/L at 6h in ANP group, which were significantly higher than those in SO group [(1063±129)U/L, (55±18)U/L, (143.1±42.2)pg/ml, (2.97±0.12)mmol/L (P<0.05)]. Under the electron-microscopy, the nucleus of thyroid parafollicular cells shrinked and mitochondrial proliferation and endoplasmic reticulum fusion appeared. After 6 h, all the organelle reduced and disappeared, and only small amount of secretory granules remained.ConclusionsChanges in the structure and function of the thyroid parafollicular cells occur in rats of ANP, and they induce the development of hypocalcemia.

Pancreatitis, acute necrotizing; Thyroid parafollicular cell; Transmission electron microscopy

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.04.011

430060 湖北武漢，武漢大學人民醫院普外科(楊波、鄧文宏、陳辰、余佳、金浩、王衛星)；鄂州市中心醫院普外科(劉黎明)

王衛星，Email:sate.llite@163.com

2012-03-19)

(本文編輯：呂芳萍)