血管緊張素Ⅱ1型受體抑制劑對人子宮內膜癌裸鼠皮下移植瘤的實驗研究

石海燕，胡維維，許 欣，楊秀媚，賴均鵬，徐園園，陶金華

（佛山市第一人民醫院 病理科，廣東 佛山528000）

子宮內膜癌是婦科常見惡性腫瘤之一。因此，體外建立子宮內膜癌模型對研究其發病機制與治療具有極為重要的意義。本研究應用血管生成因子（VEGF）和腫瘤血管密度（MVD）兩個指標評估人子宮內膜癌祼鼠皮下移植瘤內血管形成程度，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

細胞株：人子宮內膜癌HEC－1B細胞株選自上海生命科學研究所，HEC－1B細胞以常規方法復蘇、培養。取部分細胞進行種植，其余凍存于液氮罐中。實驗動物：4－6周齡BALB／C雌性裸鼠12只，體重15－16g左右，購自廣東省中山醫科大學動物中心，均置于SPF環境下飼養。將裸鼠隨機分為腫瘤組和血管緊張素Ⅱ1型受體（AT1R）腫瘤抑制組，每組6只。免疫組化試劑：CD34和VEGF均購自DAKO公司；厄貝沙坦購自Sanofi Winthrop Industrie公司。

1.2 方法

1.2.1 HEC－1B細胞的培養和細胞懸液的制備及裸鼠接種 復蘇后的細胞株置于含10%胎牛血清的MEM培養液中，于37℃、5%CO2培養基中培養。選擇處于對數生長期的細胞，用0.25%濃度的胰酶對其進行消化，然后PBS洗滌細胞2次；以1 000轉／min的轉速對細胞懸液離心5min，收集細胞，用0.9%濃度的生理鹽水懸浮細胞，將細胞濃度調整至1×106／ml，接種至裸鼠右上肢背部皮下組織。

1.2.2 分組及給藥 接種當天把裸鼠隨機分為2組，除正常飲食外，腫瘤組每天胃飼生理鹽水1次0.5ml，腫瘤抑制組每天胃飼10mg／kg的 AT1R抑制劑0.5ml，觀察裸鼠的成瘤情況，約10天左右成瘤。成瘤后4周后，處死模型鼠，取下腫瘤，部分組織存儲于液氮中備用，部分用10%甲醛固定。

1.2.3 腫瘤形態學檢測 自接種第11天起，每兩天測量1次腫瘤的體積（V＝AB2／2），A為腫瘤最大直徑，B為與A垂直的最大徑，將腫瘤體積對時間的變化繪制成腫瘤生長曲線圖。

1.2.4 組織病理觀察 用10%濃度的福爾馬林將剝取的腫瘤組織進行固定、脫水、透明、浸蠟、包埋，成功制成5μm厚的組織切片。用蘇木素－伊紅對組織切片進行染色，然后作腫瘤組織病理學檢查。

1.2.5 腫瘤血管密度（microvessel density MVD）檢測 MVD計數參照 Weidner［1］的評判標準。腫瘤組織常規切片后，每組腫瘤各取一張壞死組織最少、腫瘤細胞豐富的玻片，先在低倍鏡下尋找內皮細胞染色（CD34染色）最密集的10個區域（形成微血管最豐富的區域），在高倍鏡下觀察視野下的組織微血管數，計算每個視野的數目，取平均值，即為每個高倍鏡視野下的MVD，胞質呈棕黃色染色的內皮細胞簇或單個內皮細胞，與周圍組織有明顯界限，無論有沒有血管腔，血管腔內有沒有紅細胞均定義為1個微血管。若管腔大于8個紅細胞直徑或管腔有明顯肌層則不在計數范圍內，將兩組的MVD進行比較。

1.2.6 VEGF抗原陽性率的測定 VEGF陽性細胞判斷以胞漿出現棕黃色團塊或顆粒為準。高倍鏡下隨機計數5個高倍視野，每個視野計數100個細胞VEGF染色陽性細胞數，5個視野下平均陽性數作為每一例的陽性數，用百分數表示。VEGF染色陽性細胞數＞30%即為陽性表達。

1.3 統計學處理

全部數據均用SPSS 17.0統計軟件進行分析處理，其中，計量資料用均數±標準差（）表示，組間比較應用t檢驗，組內比較應用方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 裸鼠體重和成瘤情況觀察

腫瘤抑制組的腫瘤生長速度明顯慢于腫瘤組的腫瘤生長速度（P＜0.05），見表1、圖1。

表1 裸鼠體重和成瘤情況（）

表1 裸鼠體重和成瘤情況（）

注：與腫瘤組比較△P＜0.01，※P＜0.05。

天數 組別 體重（g） 平均體積（mm3）15.50±0.46 0腫瘤抑制組 15.71±0.59 0第11天 腫瘤組 17.05±0.28 73.04±10.36腫瘤抑制組 17.75±0.67※ 67.91±10.65※第13天 腫瘤組 18.00±0.43 106.87±16.69腫瘤抑制組 18.84±0.63△ 87.30±10.87△第15天 腫瘤組 18.88±0.35 112.42±16.22腫瘤抑制組 19.68±0.42△ 93.64±10.2△第17天 腫瘤組 19.09±0.34 118.20±16.7腫瘤抑制組 19.93±0.4△ 97.90±11.03△第19天 腫瘤組 19.31±0.36 159.31±14.62腫瘤抑制組 20.21±0.39△ 100.43±11.25△第21天 腫瘤組 19.62±0.32 202.13±16.42腫瘤抑制組 20.71±0.55△ 104.29±10.31△第23天 腫瘤組 19.72±0.34 250.52±24.88腫瘤抑制組 21.55±0.56△ 120.49±13.12△第25天 腫瘤組 19.80±0.27 285.95±25.4腫瘤抑制組 22.1±0.53△ 133.17±12.89△第27天 腫瘤組 19.84±0.22 302.86±24.87腫瘤抑制組 22.26±0.47△ 150.72±13△第29天 腫瘤組 19.90±0.29 322.45±25.93腫瘤抑制組 22.50±0.44△ 167.16±14，8△第31天 腫瘤組 19.85±0.31 382.42±32.82腫瘤抑制組 22.75±0.43△ 187.40±17.24第1天 腫瘤組△

圖1 腫瘤生長曲線圖

兩組模型鼠的平均體重：腫瘤組為19.07g，腫瘤抑制組為21.08g，裸鼠平均10天左右成瘤，直徑均大于5mm，成瘤率為100%（12／12），腫瘤隨著時間的增加而增大，4周后處死模型鼠，移植瘤表面較光滑，毛細血管豐富。腫瘤大小：腫瘤組最大徑11.34mm，平均體積210.56mm3，腫瘤抑制組最大徑9.01mm，平均體積119.13mm3，兩組之間有顯著的差異（P＜0.05）。

2.2 腫瘤組織病理學檢查

光鏡下可以見到腫瘤細胞呈彌漫分布，核大深染，核呈圓形、卵圓形或形狀不規則，核染色質不均勻，胞質少，部分細胞可見核仁，病理性核分裂多見，組織內可見壞死，腫瘤組腫瘤組織內見小灶的壞死，大小為1mm－3mm，腫瘤抑制組可見大片狀的壞死約9mm大小，兩組腫瘤組織間質血管增生情況見圖2、圖3。腫瘤組內可見肌肉內癌組織的侵犯，但未見淋巴結的轉移，見圖4。

圖2 腫瘤組HE×40 腫瘤組CD34×200 腫瘤組VEGF×200

圖3 腫瘤抑制組 腫瘤抑制組CD34腫瘤抑制組VEGF HE×40 ×200 ×200

2.3 兩組移植瘤腫瘤組織間質MVD的比較

用藥組的CD34與VEGF的表達均MVD少于對照組，兩組比較有顯著的差異性（P＜0.05）。見表2。

圖4 腫瘤組肌肉內見癌的侵犯

表2 兩組移植瘤腫瘤組織間質MVD的比較（）

表2 兩組移植瘤腫瘤組織間質MVD的比較（）

CD34 VEGF組別48.59±4.52 46.38±4.31腫瘤抑制組 15.59±3.15 15.42±3.10 t值 59.96 58.75 P值 0.腫瘤組000 0.000

2.4 兩組移植瘤腫瘤組織間質VEGF陽性率比較

腫瘤組染色后有5例VEGF陽性，陽性率為83.3%；腫瘤抑制組染色后有1例VEGF陽性，陽性率為16.7%，兩組比較有顯著性差異（P＜0.05）。

3 討論

本研究中成功的建立了HEC－1B人子宮內膜癌裸鼠皮下移植瘤模型，此模型在組織病理學、免疫組化表型都與子宮內膜癌癌細胞相同，而且腫瘤組織移植生長率為100%，這就說明此模型的生物學特性是穩定的，從而為基礎研究提供了非常有價值的動物模型。

大量研究發現幾乎所有組織都具有獨立的RAS（腎素－血管緊張素）系統，主要調節局部組織的生長和分化［2］。而多數腫瘤如肺癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌等組織中都存在局部RAS活性因子的表達上調，包括 AT1R 表達的上調［3－8］。我們之前的研究表明從正常子宮內膜上皮到非典型增生再到子宮內膜癌的發展過程中，AT1R表達能力是逐步上調的，且AT1R的表達與年齡、FIGO分期、淋巴結轉移狀況和肌層浸潤深度等因素關系密切［9］。

我們的實驗證實了AT1R抑制劑對腫瘤的生長有明顯的抑制作用，首先表現在裸鼠的體重方面，應用了抑制劑的模型體重明顯比對照組增加；其次表現在移植瘤上，應用抑制劑的移植瘤的最大直徑和平均體積均明顯小于對照組；再其次模型中移植瘤的腫瘤細胞的變化表現在兩個方面，其一，腫瘤細胞的變性、壞死，抑制劑組的壞死范圍遠遠高于對照組；其二，腫瘤間質血管的增生情況，對照組中間質血管豐富，明顯增生，而抑制劑組中腫瘤間質的血管明顯的減少。從上面的實驗可以得出，AT1R抑制劑對腫瘤生長的抑制作用非常的明顯，主要表現在抑制腫瘤組織間質內血管的生成，使腫瘤細胞供血供氧不足，從而腫瘤細胞壞死，進而起到抑制腫瘤生長的作用，因此AT1R抑制劑在惡性腫瘤的治療方面起著很顯著的作用，至于什么劑量是最合適的劑量，有待我們下一步實驗結果。

［1］Weidner N，Intratumor microvessel density as a prognostic factor in cancer［J］.Am J Pathol，1995，147（1）：9.

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［9］胡維維，陶金華，許 欣，等.血管緊張素Ⅱ1型受體和血管緊張素轉化酶在子宮內膜癌中的表達及相關性［J］.臨床實驗與病理學雜志，2011，5.