實時熒光PCR法與流式細胞術兩種方法檢測HLA－B27的比較

陳慧毅，褚為靖，張會英＊，葛艷玲，張 茜

（1.北京積水潭醫院 檢驗科，北京100035；2.衛生部北京醫院 檢驗科）

人類白細胞抗原（HLA）是一組位于人體細胞膜表面能夠識別“自己”或“非己”的抗原分子，由位于人類6號染色體短臂上的一組主要組織相容性復合體基因（MCH）編碼。這些基因包括很多基因座位，例如：HLA－A，HLA－B，HLA－DR等，每個基因座位包括很多等位基因。其中HLA－B27是HLAB基因座位上的一個重要的等位基因?，F在研究表明HLA－B27與強直性脊柱炎（Ankylosing spondylitis，AS）具有高度的相關性［1］。Brown等［2］報道AS患者中，HLA－B27抗原呈陽性者高達94%，而健康人群僅為9%。因此，HLA－B27檢測已經成為臨床上支持AS診斷的重要依據。檢測HLA－B27的方法有多種，大多數實驗室常采用的有：微量細胞毒試驗、酶聯免疫方法、流式細胞儀檢測法、PCR法等。以PCR為基礎的多種分子生物學技術被用于檢測 HLA－B27基因型，如 PCR－RFLP、PCR－SSP、PCR－SSO和PCR－LBT等，這些方法都需要在PCR后進行凝膠電泳，而且使用強誘變劑EB為染料，不僅費時費力，而且容易造成污染而出現假陽性結果，使這些PCR方法的應用受到一定的限制。實時熒光PCR是20世紀90年代發展起來的新型核酸檢測技術，此法將先進的光學設備、溫控技術、熒光素標記技術、核酸擴增技術以及計算機軟件有機地結合起來，能夠對PCR每一循環的熒光強度進行檢測，故稱為實時熒光PCR。本研究采用實時熒光PCR和流式細胞術檢測HLA－B27，比較兩種方法的優缺點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本來源 2010年8月至2011年3月北京積水潭醫院門診或住院患者138例，其中男85例，女53例。對收集到的138例外周靜脈血同時采用熒光PCR染料法和流式細胞術檢測HLA－B27。

1.2 儀器和試劑

1.2.1 流式細胞儀（EPICS－XL）和樣品制備儀（EPICS Immunology Workstation，Coulter Q－prep）購于美國貝克曼庫爾特公司。流式細胞儀檢測用試劑，異硫氰酸熒光素／藻紅蛋白（FITC／PE）標 記 的 HLA－B27／HLA－B7 單 克 隆 抗 體、IgG1－FITC／IgG2a－PE 和 CD4－FITC／CD8－PE 熒 光抗 體購于法國Immunotech公司；熒光校準微球（Flow Check）及樣品制備試劑（ImmunoPrep Reagent System）購于美國貝克曼庫爾特公司。

1.2.2 PCR擴增儀（Roche LightCycler 480），微型高速離心機（Microfuge 22Rcentrifuge）購于美國貝克曼庫爾特公司，恒溫金屬?。℉B－100）購于杭州博日科技有限公司，血液基因組DNA提取試劑盒購于天根公司，HLA－B27熒光PCR基因檢測試劑盒購于博奧生物有限公司。

1.3 方法

1.3.1 流式細胞術檢測人類白細胞抗原HLA－B27的步驟

（1）血樣采集：空腹抽取靜脈血2ml，EDTA－K3（乙二胺四乙酸三鉀）抗凝。（2）細胞熒光染色：取3支流式細胞儀專用試管，分別標注對照管、補償管和患者血樣管。對照管加IgG1－FITC／IgG2a－PE熒光抗體10μl，補償管加CD4－FITC／CD8－PE熒光抗體10μl，患者血樣管加 HLA－B27－FITC／HLA－B7－PE熒光抗體10μl。然后分別在3支試管中加入患者EDTA抗凝全血各100μl，輕輕混勻。室溫避光保存15－20min。（3）樣品制備：使用樣品制備儀進行溶血和固定。（4）洗滌和離心：將制備樣品管放置離心機內，580×g離心5min；離心后棄上清液。向含沉淀細胞的試管中加入pH值為7.2的PBS液1 ml，混勻。580×g再次離心5min，棄上清液，再次向含沉淀細胞的試管中加入pH值為7.2的PBS液1ml，混勻備用。（5）流式細胞儀檢測：上機檢測前，用熒光校準微球校正流式細胞儀光路和流路，使變異系數值（CV）在2.0之內。建立并選定流式細胞儀檢測HLA－B27的方案。將對照管插入儀器的進樣口，找出3組細胞，選擇1個細胞群，調節確定合適的放大電壓。將補償管插入儀器的進樣口，調節熒光補償。將患者血樣管插入儀器進樣口，當標本的淋巴細胞計數＞5 000時，根據HLA－B27細胞數表達的百分比和平均熒光強度判斷檢測結果。（6）結果判斷HLA－B27陽性結果判斷方法為：B27表達的細胞數＞90%和平均熒光強度＞8。

1.3.2 實時熒光PCR法檢測人類白細胞抗原HLA－B27步驟

（1）血樣采集：空腹抽取靜脈血2ml，乙二胺四乙酸三鉀（EDTA－K3）抗凝。（2）提取基因組：取血液樣本500μl，放入1.5ml離心管中，加入1ml的細胞裂解液，顛倒混勻，1 1500×g離心1min，棄去上清，留下細胞核沉淀。向離心收集到的細胞核沉淀中加入200μl緩沖液GS，再加入20μl蛋白酶K溶液和200μl緩沖液GB，充分顛倒混勻，56℃放置15分鐘，直至溶液變清亮。加入200μl無水乙醇，充分顛倒混勻。將上述所得溶液加入到吸附柱中，13 400×g離心30s，棄去收集管中廢液。向吸附柱中加入500μl緩沖液GD，13 400×g離心30s，棄去收集管中廢液。向吸附柱中加入700μl漂洗液，13 400×g離心30s，棄去收集管中廢液。向吸附柱中加入500μl漂洗液，13 400×g離心30s，棄去收集管中廢液。將吸附柱放回收集管，13 400×g離心2min，倒掉廢液。將吸附柱置于室溫放置15 min，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。將吸附柱轉入一個干凈的離心管中，滴加50μl洗脫緩沖液TB，室溫放置3min，13 400×g離心2min，將基因組收集到離心管中。（3）基因擴增：從試劑盒中取出PCR反應液，室溫融化。分別向裝有PCR反應液的管中加入1μl模板，蓋緊管蓋，置于PCR儀上按照以下程序進行擴增。基因擴增程序：37℃600s，1個循環；96℃ 900s，1個循環；96℃ 25s，62℃30s，72℃30s，40個循環。溶解曲線分析程序：95℃10s；72℃10s；95℃10s；50℃10s。（4）結果判讀：當質控峰與B27峰在目標溫度區間的熒光信號最大值的比值小于等于2.925，此樣本為陽性標本。當質控峰與B27峰在目標溫度區間的熒光信號最大值的比值大于2.925，此樣本為陰性標本。

1.4 統計學分析

采用SPSS 10.0統計軟件包進行統計學分析，2種檢測方法檢出陽性率比較采用配對χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 流式細胞術和實時熒光PCR法檢測兩種方法同時檢測 檢測結果見表1。共檢測138例患者（男性85例，女性53例），流式細胞術檢出陽性為36例，實時熒光PCR法檢出陽性為39例，經配對χ2＝1.33，兩種方法的檢出率差異無統計學意義（P＞0.05）。2種方法符合率為97.8%（135／138），見表1。

表1 兩種方法同時檢測結果比較

2.2 流式細胞術和實時熒光PCR法檢測HLAB27同時檢測出的陰性標本如圖1所示，它們同時檢測出的陽性標本如圖2所示。

圖1 陰性標本

圖2 陽性標本

2.3 在流式細胞術檢測HLA－B27發現7例可疑標本，即所謂雙陽性標本（HLA－B27和 HLA－B7均表現為陽性），他們的共同特點是熒光強度＞8，但HLA－B27細胞表達百分比數不足90%，見表2。流式細胞術通常的報告的結果為陰性，但實時熒光PCR法并不都一致，見圖3，A圖兩種檢測方法結果不一致，B圖兩種方法檢測結果均為陰性。

表2 可疑標本檢測結果比較

圖3 可疑標本

3 討論

Chou等［3］在家族性研究中發現 HLA－B27是一個有用的預測指標，因為HLA－B27陰性個體中，發展為AS的可能性幾乎是零，而在HLA－B27陽性的個體中，發生AS的可能性是20%－30%。因此，HLA－B27對臨床診斷提供關鍵的支持依據。經過采用流式細胞術和實時熒光PCR法同時檢測138例患者血中HLA－B27表達，發現兩種檢測方法符合率為97.8%，其準確性、可靠性和自動化程度完全符合臨床檢測要求。但又各有其優缺點。

流式細胞術檢測HLA－B27原理是采用熒光標記的單克隆抗體與細胞表面的HLA－B27抗原相結合，然后用流式細胞儀檢測HLA－B27表達的細胞數和熒光強度，判斷結果。這種方法操作簡單，自動化程度高，一份樣品40分鐘內便可得出結果，而且重復率好。但流式細胞術也有不足之處。由于HLA－B27抗體除了能和HLA－B27抗原結合之外，與HLA－B7抗原也有一定的交叉反應。正是因為HLA－B7抗原和HLA－B27抗原競爭性的與HLAB27抗體結合，所以HLA－B27檢測中可能出現假陽性的可能。Macardle等［4］報道流式細胞術檢測HLA－B27誤差率為5%，其中部分原因就是HLAB7抗原陽性的患者，可能會給HLA－B27的判斷造成誤差。本研究采用HIA－B27／HLA－B7雙標記熒光探針檢測HLA－B27，其優點在于避免了假陽性結果的報告，但對于假陰性的誤判難以克服。

實時熒光PCR法檢測 HLA－B27原理，是在PCR反應液加入熒光染料，該染料能與雙鏈DNA特異性結合，通過實時檢測反應體系熒光信號強度，達到檢測PCR擴增產物的目的。實時熒光PCR法直接檢測 HLA－B27抗原的編碼基因，不必有與HLA－B7產生交叉反應之虞，故能準確地做出判斷。兩種方法的檢測結果有3例標本不符，主要原因是本研究中流式細胞術檢測HLA－B27和HLA－B7兩種抗原，如果標本HLA－B27平均熒光強度＞8而表達的細胞數＜90%，我們高度懷疑是HLA－B7抗原引起的干擾，進而臨床上我們傾向于報告HLA－B27抗原陰性，但是這就會造成兩種抗原都是陽性標本的漏檢。我們分析了類似的7例標本，這些標本的共同特點是平均熒光強度＞8，而B27表達的細胞數＜90%，其中3例標本兩種方法檢測結果不符，4例標本結果完全符合。實驗結果說明平均熒光強度＞8而B27表達的細胞數＜90%的情況下，流式細胞術已無能為力，提示需要采用微量細胞毒［5］或PCR方法進行確認，而實時熒光PCR法確實能彌補這一不足。擬采用流式細胞術檢測樣品，需當天處理，而且不能凍存。而采用實時熒光PCR法檢測的樣品的可以在－80℃長期保存。這樣就為我們提出一種可采納的方法：將流式細胞術檢測數的雙陽性標本放入冰箱凍存，待積攢到一定數量之后，用實時熒光PCR法作進一步確認。如果本室的實驗條件不允許，也可集中送到其他實驗室檢測。為臨床提供可靠和準確的數據。本研究中實時熒光PCR法與流式細胞術兩種方法檢測人類白細胞抗原HLA－B27的符合率高，雖然實時熒光PCR法的操作較流式細胞術繁瑣，但在解決雙陽性標本時具有優越性，使臨床的檢測結果更加準確和可靠。

［1］López de Castro JA.HLA－B27and thepathogenesis of spondyloarthropathies［J］.Immunol Lett，2007，108：27.

［2］Brown MA，Pile KD，Kennedy LG，et al.HLA class I associations of ankylosing spondylitis in the white population in the United Kingdom［J］.Ann Rheum Dis，1996，55：268.

［3］Albrecht J，Müller HA.HLA－B27typing by use of flow cytofluorometry［J］.Clin Chem，1987，33：1619.

［4］Macardle PJ，McEvoy R，Jovanovich S.HLA－B27expression by flow cytometry：an analysis of 7years quality assurance data［J］.J Immunol Methods，2000，243：51.

［5］楮為靖，張會英，高新生，等.流式細胞儀檢測人類白細胞抗原－B27與微量細胞毒法的比較［J］.中華檢驗醫學雜志，2008，31：520.