體外定向誘導大鼠骨髓間充質干細胞分化為心肌樣細胞的實驗研究

孫慶國，趙文靜，王日中，陳 鋒

（吉林省肝膽病醫院 檢驗科，吉林 長春130062）

骨髓間充質干細胞（mesenchymal stem cell，MSCs）是骨髓中一類具有多分化潛能的干細胞，在一定誘導條件下不僅可分化為中胚層的骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、心肌細胞，而且能分化成外胚層的神經元、神經膠質細胞及內胚層的肝細胞［1－4］。MSCs向心肌細胞的分化為擴張性心肌病、心肌梗死等的治療帶來了新的希望［5］。研究證明，5－氮胞苷（5－aza）可誘導MSCs向心肌樣細胞分化，但如何促進MSCs向心肌細胞分化仍是需要重點研究的問題，為此本研究分離培養大鼠骨髓MSCs，并采用擴張性心肌病大鼠血清和5－氮胞苷誘導培養骨髓MSCs，為MSCs向心肌細胞分化選擇最適微環境提供實驗基礎和理論依據。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

DMEM培養基（Gibaco），胎牛血清（杭州四季青生物技術公司）；胰蛋白酶（Introvigen）、5－氮胞苷（Sigma）；淋巴細胞分離液（密度：1.077，上海試劑二廠，中國），SD大鼠（吉林大學基礎醫學院醫學動物實驗中心），兔抗大鼠肌鈣蛋白（cTnT）單抗（丹麥DAKO公司），SP免疫組化染色試劑盒（福州邁新生物技術公司）。

1.2 大鼠骨髓MSCs的分離培養

選用8天SDE大乳鼠4只，斷頭處死，無菌分離股骨和脛骨，沖洗骨髓腔制成細胞懸液，淋巴細胞分離液密度梯度離心分離單個核細胞，接種2×106個單個核細胞于10cm培養皿中，37℃、5%CO2培養48h后換液，培養約10～14天細胞接近融合時按1∶4傳代，并標記為Passage1（P1）；重復以上操作，傳代培養。

1.3 大鼠骨髓MSCs的表型鑒定

取3代MSCs細胞1×104個／孔接種于24孔培養板中（孔中預先放置無菌蓋玻片），37℃、5%CO2培養，待MSCs生長接近80%融合時，取出蓋玻片，PBS沖洗，4%多聚甲醛固定15min，蒸餾水沖洗，免疫細胞化學染色檢測MSCs細胞表面標志CD44、CD29的表達，嚴格按照說明書進行操作。

1.4 擴張性心肌病大鼠模型血清＋5－aza誘導培養大鼠MSCs

按照參考文獻［6］方法建立擴張性心肌病大鼠模型，造模成功后無菌腹主動脈采血，分離血清，－80℃冰箱保存備用。取第3代大鼠MSCs，以細胞濃度2×105／孔接種于6孔板內（孔內預置無菌蓋玻片），過夜培養后實驗組采用5μmol／L 5－aza干預培養24h后棄去培養液，改用含20%擴張性心肌病大鼠血清的低糖DMEM繼續培養；對照組始終采用常規培養基同等條件下培養，每3～4天換液一次，于加入擴張性心肌病大鼠血清后1、2、3、4周取出蓋玻片，4%多聚甲醛固定，－20℃保存待檢。

1.5 免疫細胞化學染色檢測MSCs cTnT的表達

取出已固定細胞爬片，室溫放置30min，PBS沖洗后，免疫細胞化學染色檢測cTnT的表達（兔抗大鼠肌鈣蛋白單抗1∶200稀釋），結果判定：MSCs胞漿內出現棕褐色顆粒為陽性。顯微鏡下每組觀察計數5個低倍視野，計算陽性細胞百分率。

1.6 統計分析

2 結果

2.1 大鼠骨髓MSCs的分離培養和表型鑒定

淋巴細胞分離液密度梯度離心后獲得的單個核細胞培養48小時后，部分細胞貼壁，并有少部分細胞已開始分裂增殖（圖1A、B），隨著培養時間的延長，細胞集落不斷增多，擴大，培養約10～14天細胞達80%融合。傳代骨髓MSCs很快貼壁，呈梭形，增殖迅速，約6～7天即可傳代培養。

圖1 Morphological features of rat BMSCs（×40）

骨髓MSCs具有特征性的表面標志，其特點是不表達造血干細胞的表面標志CD34和CD45，表達CD29、CD44、CD105和CD166等間充質干細胞的特異性表面標志［7］，免疫細胞化學染色結果顯示表明：本研究分離培養的骨髓MSCs高表達CD44和CD29（圖2），不表達CD34。

圖2 The expression of CD44and CD29in rat BMSCs（×100）

2.2 擴張性心肌病大鼠模型血清＋5－aza誘導培養MSCs的形態學觀察和cTnT的免疫組化染色結果

對照組大鼠骨髓MSCs未發生形態改變，呈成纖維細胞樣整齊排列，培養第7天即長滿瓶底；擴張性心肌病大鼠模型血清＋5－aza誘導培養組大鼠骨髓MSCs生長良好，7天后細胞形態即發生變化，體積變大，緊密平行排列生長，而且隨著培養時間的延長，梭形細胞的比例下降，細胞多呈桿狀，少數細胞呈不規則外形，相鄰細胞間的胞膜有接觸，逐漸相連呈肌管狀。

擴張性心肌病大鼠模型血清＋5－aza誘導組MSCs誘導培養7、14、21、28天cTnT均呈陽性表達，其表達陽性率分別為（18.4±3.2）%、（24.5±4.8）%、（50.8±6.7）%和（75.4±10.5）%，結果表明隨時間延長表達陽性率增高，不同時間點陽性率比較差異有統計學意義（P＜0.05）；未經5－aza誘導的B MSCs中未見cTnT表達（圖3）。

圖3 Morphological features and cTnT expressiojn of rat BMSCs in DCM rat serum group（×100）

3 討論

MSCs在骨髓中的含量極少，僅占骨髓細胞的0.001%－0.01%［8］，需要在體外進行分離擴增培養才能滿足細胞移植的需要。分離骨髓MSCs的分離方法主要有4種：密度梯度離心法貼、壁培養法、流式細胞儀分選法和免疫磁珠分選法。本研究采用淋巴細胞分離液密度梯度離心和貼壁培養法相結合分離培養大鼠骨髓MSCs，研究結果顯示，密度梯度離心獲得的單個核細胞培養48h后部分細胞貼壁，并呈集落式生長，傳代細胞再形成集落式生長，呈均勻有序的成纖維細胞樣細胞生長，傳代周期為6－7天。主要從細胞的形態和培養特性、表面細胞標志的表達以及分化潛能3個方面鑒定MSCs，本研究采用免疫細胞化學染色檢測大鼠骨髓MSCs的表型，結果表明分離培養的細胞高表達CD44和CD29，CD34表達陰性。結果顯示本研究獲得較純化，高活性的BMSCs，與文獻報道一致，為進一步實驗奠定了基礎。

MSCs可以分化為心肌細胞和血管內皮細胞，目前MSCs已經成為治療心血管疾病的種子細胞［9］，成為心血管疾病領域的研究熱點，5－aza是目前公認的可以誘導MSCs向心肌細胞分化的藥物，但有文獻報道5－aza在誘導MSCs分化為心肌細胞的同時，其可以誘導 MSCs的凋亡［10－12］。同時大量研究結果表明，體外模擬心肌微環境，可高效誘導MSCs分化為心肌細胞。cTnT是心肌肌鈣蛋白中具有較高特異性的亞型，是鑒定心肌源性細胞的特異性標志物［13］，本研究在體外采用擴張型心肌病大鼠模型血清＋5－aza對MSC進行誘導，并采用免疫細胞化學染色方法鑒定cTnT的表達，結果顯示擴張型心肌病大鼠模型血清＋5－aza誘導培養組BMSCs生長狀態良好，7天后細胞的形態即發生明顯變化，并隨著培養時間的延長呈桿狀，排列具有方向性，逐漸相連呈肌管狀，免疫細胞化學染色結果顯示誘導組 MSCs的cTnT呈陽性表達，而未經5－aza誘導BMSCs中未見cTnT表達，本研究在體外找到更適宜誘導BMSCs向心肌細胞分化的條件，為進一步實驗奠定了基礎，相關研究正在深入進行中。

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