人巨細胞病毒pp150－pp65蛋白的表達與應用

金玉芬，李艷蕾，華 艷，張曉剛，于 庭＊

（1.吉林大學第二醫院，吉林 長春130041；2.北京英諾特生物技術有限公司，北京100070）

人巨細胞病毒（Human Cytomegalovirus，簡稱HCMV）屬皰疹病毒β亞科，是一種DNA病毒，其感染在人群中廣泛存在，我國人群中HCMV感染相當嚴重。HCMV是世界范圍內引發先天性感染最常見的一種病毒，在活產兒中感染率為0.2%－2.0%，是風疹病毒感染的2倍［1］。婦女在妊娠初期受HCMV原發感染是引起胎兒宮內感染和發育缺損的重要原因，在孕期原發性感染HCMV的胎兒和新生兒中，80%可導致智力低下、畸形和死亡［2］。HCMV也是器官移植失敗和艾滋病病人并發感染死亡的主要原因之一［3］。對非免疫缺陷者常導致長期隱性感染，甚至引起感染細胞的轉化、畸變或癌變等［4］。因此快速準確的診斷HCMV病毒感染具有十分重要的意義。

HCMV的結構蛋白包括衣殼蛋白、被膜蛋白以及包膜蛋白。HCMV pp65是HCMV被膜蛋白中最主要的一種，主要是參與病毒基因調節以及改變宿主細胞的代謝，而且在不同的HCMV病毒株中，pp65具有高度的保守性［5］，含有IgM結合表位，對判斷急性感染具有很重要的意義。Rolf［6］等的實驗表明pp150的495－691aa片段是確診HCMV既往感染的最適抗原（IgG結合表位），在檢測HCMV原發及急性期感染中起著極其重要的作用。

1 實驗材料

人巨細胞病毒培養物為中國預防醫學科學院病毒研究所惠贈；細菌菌株及載體：pET28a質粒由本實驗室保存，E.coli BL21購自北京新經科科技有限公司。酶及其他試劑：DNA polymerase，T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶、限制性內切酶NdeⅠ和XhoⅠ均為TaKaRa公司產品；蛋白質分子質量標準、Ni－蛋白純化柱購自北京新經科科技有限公司；試劑盒：抗巨細胞病毒抗體IgG檢測試劑盒（酶聯免疫吸附法）和抗巨細胞病毒抗體IgM檢測試劑盒（酶聯免疫吸附法）為意大利SORIN公司產品。

2 試驗方法

2.1 聚合酶鏈反應引物

根據目的片段的DNA序列，設計兩對引物（P1，P2）和（P3，P4）。P1和P2用于擴增pp150基因片段，P3和P4用于擴增pp65基因片段；引物P1和P4分別帶有NdeⅠ和XhoⅠ的酶切位點，引物P2和P3順序互補，并共同對應于pp150上述片段的3’末端和pp65上述片段的5’末端序列。引物合成由上海生物工程有限公司完成。引物序列如下：

P1：ATCGCATATGGGCGGCGGTTCGGCCTTCTCG；P2：CGCAGCCACTACCCTTCCCGGGCTGGCC；P3：AAGGGTAGTGGCTGCGCTCTTCTTTTTCGATATCG；P4：ATCGCTCGAGGGGCTGCCATACGCCTTCCAATTCGGC。

2.2 目的基因的克隆

取病毒培養液1μl，加入10×Pfu高保真酶緩沖液5μl，濃度2mmol／L dNTPs 5μl，P1、P2引物各2μl，Pfu高保真酶0.5μl，加滅菌雙蒸水至50 μl。充分混勻。反應條件為變性94℃30s，退火65℃30s，復性72℃60s，進行30個循環，再72℃延伸10min。P3、P4引物克隆方法同上。

再以第一輪PCR擴增得到的pp150片段和pp65片段為模板，加入引物P1和P4，擴增pp150－pp65片段；得到串聯的目的基因重組片段pp150－pp65。反應條件為pp150片段和pp65片段分別為1μl，加入10×Pfu高保真酶緩沖液5μl，濃度2 mmol／L dNTPs 5μl，P1、P4引物各2μl，Pfu高保真酶0.5μl，加滅菌雙蒸水至50μl。充分混勻。反應條件為變性94℃30s，退火65℃30s，復性72℃90s，進行30個循環，再72℃延伸10min。

2.3 pET28a－pp150－pp65重組質粒的構建與鑒定

純化的PCR產物pp150－pp65經NdeI和XhoI酶切，并與經過同樣處理的pET28a原核表達載體連接，轉化到大腸桿菌TOP10中，抽取質粒DNA，進行酶切鑒定。并轉化到大腸桿菌BL21中。

2.4 pET28a－pp150－pp65融合蛋白的誘導表達

將含pET28a－pp150－pp65重組質粒的 BL21菌液以1∶100的比例加入到LB培養液中，37℃振蕩培養2小時后加入IPTG至終濃度為1mmol／L，37℃誘導3小時后離心收集菌體，重懸于2×樣品緩沖液中，100℃煮沸，進行SDS－PAGE電泳分析。

2.5 表達蛋白的純化

取誘導后的菌體培養液離心收集菌體，經超聲破碎后利用Ni－蛋白純化柱進行純化。具體操作按照說明書進行。分別收集洗脫峰蛋白，并進行SDSPAGE凝膠電泳分析。

2.6 重組蛋白的抗原性分析

將重組的菌體蛋白經SDS－PAGE凝膠電泳后，切膠進行蛋白質電轉移，將目的蛋白電轉至NC膜上，用含質量濃度50g／L脫脂奶的PBS封閉NC膜，4℃過夜，PBS洗膜3次。以封閉液1∶20稀釋陽性血清，與NC膜于37℃共同孵育2h后，用PBS洗膜。加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗人IgG，37℃孵育1h，PBS洗膜后TMB顯色，至目的條帶顯色清晰時終止反應。

2.7 巨細胞IgG／IgM抗體聯合檢測試劑盒（膠體金法）的建立

按經典的氯化金－檸檬酸三鈉還原法制備膠體金液。用鼠抗人IgM（μ鏈）單克隆抗體、重組巨細胞病毒抗原和兔抗巨細胞病毒抗體最佳包被濃度包被硝酸纖維素膜，并用方正滴定法確定最佳包被濃度，膠體金標記重組巨細胞病毒（CMV）抗原為示蹤物，加入待檢血清，觀察檢測線和質控線位置顏色的變化。

3 結果

3.1 目的基因的克隆和鑒定

PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定，在1 167bp左右可見特異性擴增條帶。將PCR擴增得到的pp150－pp65目的基因純化后，與相同酶切的質粒pET28a連接，最終連接到表達菌體BL21中。表達質粒經雙酶切鑒定，得到1 178bp長度的目的基因片段。與預期大小一致（圖1）。

序列測定結果表明插入序列與目的片段完全一致。

3.2 蛋白純化

將空載體質粒pET28a和重組質粒pET28app150－pp65的菌液進行IPTG 誘導后，經SDSPAGE電泳檢測，看到空載體質粒pET28a沒有表達蛋白；而含重組質粒 pET28a－pp150－pp65菌經IPTG誘導后，在分子量45kd處出現一條新的蛋白帶，其大小與推測的ppET28a－pp150－pp65融合蛋白分子量一致，表達量約占菌體總蛋白的40%左右（見圖2）。

3.3 Western blot鑒定

將純化的目的蛋白進行 Western blot免疫印跡，證實在45kd處有一特異性條帶（見圖3）。說明表達的pET28a－pp150－pp65蛋白有較好的免疫學活性。

圖1 CMV PCR擴增產物（從左至右分別為：蛋白 Marker，pp150－pp65）

圖2 pET28a－pp150－pp65表達產物的SDS－PAGE分析

圖3 純化產物的Western blot分析

3.4 巨細胞IgG／IgM抗體聯合檢測試劑盒（膠體金法）的建立

3.4.1 最佳反應條件的確定 用鼠抗人IgM（μ鏈）單克隆抗體、重組巨細胞病毒抗原和兔抗巨細胞病毒抗體包被硝酸纖維素膜，包被濃度分別為：2 mg／ml、2mg／ml和5mg／ml，包被量為1.0μl／cm；膠體金標記重組巨細胞病毒（CMV）抗原為示蹤物，膠體金標記物噴點量為25μl／cm，最佳反應時間為20分鐘。

3.4.2 與進口試劑盒的判定比較 用意大利SORIN的抗巨細胞病毒抗體IgG檢測試劑盒（酶聯免疫吸附法）和抗巨細胞病毒抗體IgM檢測試劑盒（酶聯免疫吸附法）與本研究研制的巨細胞病毒抗體（IgM／IgG）聯合檢測試劑盒（膠體金法）對本醫院的600份血清分別進行對比。結果如下表1、表2所示。

表1 與意大利SORIN的抗巨細胞病毒抗體IgG檢測試劑盒（酶聯免疫吸附法）進行對比

表2 與意大利SORIN的抗巨細胞病毒抗體IgM檢測試劑盒（酶聯免疫吸附法）進行對比

根據實驗結果得出，本研究研制的巨細胞IgG／IgM抗體聯合檢測試劑盒（膠體金法）與意大利SORIN的CMV IgG抗體檢測試劑盒（酶聯免疫吸附法）的陽性符合率和陰性符合率分別為92.7%和83.1%，總的符合率為90.2%。與意大利SORIN的CMV IgM抗體檢測試劑盒（酶聯免疫吸附法）的陽性符合率和陰性符合率分別為88.1%和89.2%，總的符合率為88.5%。

4 討論

目前巨細胞病毒感染診斷方法有脫落細胞及組織病理檢查、病毒分離、分子雜交試驗和血清學檢查等［7］，但由于前三種方法技術設備要求高，檢測周期長的局限性，無法廣泛使用，而血清學檢查具有簡便快速的特性使其在臨床上得到廣泛應用。目前大多數檢測試劑采用的HCMV蛋白質抗原主要是來源于病毒培養物或是重組表達的單一蛋白片段，由于蛋白質抗原純度低及特異性差，造成假陽性而降低檢測特異性；或者由于單一片段抗原蛋白所含抗原決定簇較少，所識別的抗體相應較少，易造成假陰性而降低檢測敏感性。雖然多種單一片段組合制備檢測試劑也可以避免上述問題，但必然要求多次進行提取純化過程，而且小分子蛋白質或多肽的提純技術要求更高，工作效率太低。

目前國內檢測 HCMV－IgM 和 HCMV－IgG主要采用ELISA法，但該法檢測所需時間長，操作步驟繁瑣、易受類風濕因子等因素的影響，所以結果不穩定。而膠體金法與酶聯免疫分析法比較具有便捷、快速、操作簡單等多方面的優點。但是目前市場上僅有的一些膠體金法試劑盒都是單獨檢測HCMV－IgM或HCMV－IgG抗體，尚無同時檢測 HCMV－IgM和IgG的產品。

本研究選擇pp150的483－682aa，pp65的357－545aa，通過PCR方法連接并制備重組蛋白pp150－pp65，通過 Western blot鑒定該融合表達具有較好的免疫學活性。根據間接法和捕獲法原理制備巨細胞病毒IgG／IgM聯合抗體檢測試劑盒（膠體金法），并分別與意大利SORIN公司的CMV抗體IgG檢測試劑盒（酶聯免疫吸附法）和CMV抗體IgM檢測試劑盒（酶聯免疫吸附法）進行比較，符合率分別為90.2%和88.5%。研究結果表明pp150－pp65重組蛋白具有高特異性、強免疫原性，而根據該融合蛋白制備的巨細胞病毒IgG／IgM聯合抗體檢測試劑盒（膠體金法）不僅操作簡單，而且針對原發感染或者急性感染不同時期的血清都能檢測，不再受感染時間的限制，具有很好的應用價值，完全能滿足市場的需要。

［1］牛向蘭，侯林浦，谷學英.巨細胞病毒原發感染與非原發感染的鑒別診斷方法［J］.中國生育健康雜志，2008，19（2）：95.

［2］Middeldorp JM.Jongsma J，Haar AT，et al.Detection of immunoglobulin M and G antibodies against cytomegalovirus early and late antigend by enzyme－linked immunosorbent assay［J］.J Clin Microbiol，1984，20（4）：763.

［3］Gaytant MA，Steegers EA，Semmekrot BA，et al.Congenital cytomegalovirus infection：review of the epidemiology and outcome［J］.Obstet Gynecol Surv，2002，57（4）：245.

［4］Huang ES.The pathogenicity of Human Cytomegalovirus.Springer－Vellag［J］.Berin，1993，1.

［5］邱玉紅.人巨細胞病毒PP65的基礎及應用研究［J］.國外醫學婦幼保健分冊，2003，14（2）：92.

［6］Rolf V，Vornhagen R，Plachter B，et al.Early serodiagnosis acute human cytomegalovirus infection by enzyme－linked immunosorbent assay using recombinant antigens［J］.J Clin Microbio，1994，32（4）：981.

［7］Lazzarotto T，Guerra B，Lanari M，et al.New advances in the diagnosis of congenital cytomegalovirus infection［J］.J Clin Virol，2008，41（3）：192.