大鼠菌血癥模型的建立及其感染時對肝臟功能的影響

李京京，王 丹，吳 剛，趙永峰＊，馮瑞祥

（武警江蘇總隊南京醫(yī)院1.影像科；2.檢驗科，江蘇 南京210028）

菌血癥是常見的外科感染性并發(fā)癥，它可引起嚴重的SIRS和MODS，在臨床上具有很高的致死率［1，2］。導(dǎo)致菌血癥的原因有很多，例如創(chuàng)傷、術(shù)后感染、靜脈置管、腸道細菌移位等［3］。如何早期診斷感染的發(fā)生，是我們目前臨床面臨的重要問題。盡管目前臨床上有諸多感染檢測指標如體溫、白細胞計數(shù)、C－反應(yīng)蛋白、細胞因子（TNF－α、IL－6）等，但由于這些檢測指標缺乏特異性，在很大程度上影響了對感染早期診斷的準確性。因此，建立一種重復(fù)性好、簡單可靠的菌血癥動物模型，對我們研究細菌感染的發(fā)病機制以及篩選感染標志物具有重要的意義。

1 材料和方法

1.1 菌株和動物

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumonia）和大腸桿菌（Escherichia coli）由本室分離，源自大鼠腸道。SD大鼠，由南京軍區(qū)南京總醫(yī)院實驗動物中心提供，雌性，180－200g。

1.2 主要試劑

麥康凱培養(yǎng)基購自O(shè)XOID公司，PCT試劑盒購自R＆D公司。

1.3 細菌培養(yǎng)

將－80℃保存的肺炎克雷伯菌和大腸桿菌菌種接種于新鮮配制的LB液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18h。然后離心，用滅菌的PBS洗滌菌體2次，后用無菌的生理鹽水重懸菌體，并調(diào)整菌液濃度為（2－4）×1010CFU／ml。

1.4 菌血癥感染模型的制備

實驗分組：SD大鼠64只，雌性，體重180－200 g，將其隨機分為3組：生理鹽水對照組（16只）；肺炎克雷伯菌感染組（24只），大腸桿菌感染組（24只）。將大鼠適應(yīng)1周后，開始造模。在感染的第0天，對照組尾靜脈注射無菌生理鹽水（0.3ml／只），對于感染組，分別尾靜脈注射肺炎克雷伯菌和大腸桿菌菌液（0.3ml／只）。注射完成后，分別在感染的第4h、8h、24h、48h、72h、1w 時間點，各處死4只大鼠，無菌收集血液，用于白細胞計數(shù)、血漿降鈣素原（Procalcitonin，PCT）檢測、血液生化以及血培養(yǎng)等分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件，對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，依不同情況進行 Mann－Whitney U test和單因素方差分析，細菌計數(shù)結(jié)果以中數(shù)（范圍）表示，其它實驗結(jié)果以均數(shù)±標準差（）表示。

2 結(jié)果

2.1 感染大鼠血液中白細胞的變化 血液中的白細胞（WBC）在感染和炎癥反應(yīng)發(fā)生時有數(shù)量的變化，在臨床上被廣泛用來監(jiān)測感染的發(fā)生，本結(jié)果顯示，在大鼠感染后第4－8h時，白胞數(shù)量明顯降低，24－72h時開始升至正常水平，而1周又顯著上升，呈現(xiàn)先低后高的趨勢，見表1。

表1 菌血癥大鼠血液中白細胞計數(shù)結(jié)果

2.2 感染大鼠血液中細菌數(shù)量的變化 本研究結(jié)果顯示，血液中的活菌數(shù)量在感染后第4－8h時，活菌數(shù)最高，可達到2×103CFU／ml。24－72h時細菌數(shù)量有所降低，而1周時，血液細菌培養(yǎng)已為陰性，見表2。

2.3 感染大鼠血漿PCT水平的變化 結(jié)果顯示，在大鼠感染細菌后4h時，其體內(nèi)血漿中的PCT開始顯著增高（P＜0.01），8h－48h時，一直維持顯著增高水平（P＜0.01）。感染后72h時，PCT水平開始降低。一周時，肺炎克雷伯菌感染組其PCT略有顯著差異，而大腸桿菌感染組，其PCT水平已降至正常，見表3。

2.4 感染大鼠血漿肝功能酶譜及蛋白的變化 結(jié)果顯示，在大鼠感染細菌后4h－8h時，其血漿中的ALT、AST開始增高（P＜0.05），而到感染后期時，剛呈現(xiàn)下降趨勢。GGT在感染細菌8h時，開始增高，48h－1w時，顯著增高（P＜0.01），CHE則顯著降低（P＜0.01）。TP和 ALB在感染24h－72h時，一直維持顯著降低的水平（P＜0.01），至1w時，恢復(fù)至正常水平，見表4，5。

表2 菌血癥大鼠血液中細菌培養(yǎng)計數(shù)結(jié)果

表3 菌血癥大鼠血漿PCT水平

表4 大腸桿菌感染大鼠血漿生化指標的變化

表5 肺炎克雷伯菌感染大鼠血漿生化指標的變化

3 討論

肺炎克雷伯菌和大腸桿菌是臨床常見的血培養(yǎng)陽性細菌，它是導(dǎo)致臨床菌血癥發(fā)生的主要菌種［4，5］。在本研究中，我們利用本室分離的肺炎克雷伯菌和大腸桿菌通過尾靜脈感染的方式建立了大鼠的感染模型，研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠感染兩種細菌后，其精神狀態(tài)、血液生化和微生物等多項指標均發(fā)生了顯著的變化，其發(fā)病過程符合菌血癥的病理特征，表明本模型建立可靠，為我們研究菌血癥提供了有效的感染模型。

在臨床上，血液中的白細胞數(shù)量通常被用來反應(yīng)感染的發(fā)生。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)，大鼠在感染的急性期（4－8h），血液中的白細胞數(shù)量顯著降低，只有當大鼠在感染后1周時才顯著升高。這可能是由于在感染的急性期，由于大量的細菌進入血液中，機體為了迅速清除入侵的細菌，消耗了白細胞池中貯存的大量白細胞，造成了外周循環(huán)血液中白細胞數(shù)量的顯著降低。當進入感染后期時，機體補充了大量的白細胞，使得血液中的白細胞數(shù)量呈現(xiàn)顯著增高的趨勢。由于大量的研究表明，創(chuàng)傷、炎癥、腫瘤等諸多因素均可造成血中白細胞數(shù)量的增高，所以白細胞計數(shù)對于早期細菌感染預(yù)警缺乏較強的特異性。

降鈣素原（Procalcitonin，PCT）是近年來新發(fā)現(xiàn)的用于診斷全身性感染的標志物，PCT是無激素活性的降鈣素（Calcitonin，CT）前肽物質(zhì)，是由116個氨基酸組成，相對分子量為13kD的糖蛋白。PCT在生理情況下，由甲狀腺的C細胞合成分泌。正常人血漿PCT水平很低，其值通常＜0.1ng／ml。而嚴重感染并有全身表現(xiàn)時，PCT水平明顯升高，有時可超過100ng／ml。這時PCT大部分由甲狀腺以外的實質(zhì)器官組織產(chǎn)生［6，7］。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)，大鼠在細菌感染后4h時，其血液中PCT的水平即發(fā)生顯著升高，并且在8h－48h時，一直維持顯著增高水平。ROC分析表明，PCT在細菌感染后8－48 h，較之其它標志物（如CRP或白細胞數(shù)量等）具有較高特異性和準確性。另外，大量的研究資料表明，PCT在病毒感染或自身免疫性疾病所致炎癥反應(yīng)時，其通常處于較低的水平，因此可以用來區(qū)分細菌和病毒所致的感染以及無菌性炎癥。但是，在局部存在感染時，PCT水平變化不顯著［8，9］。綜上，我們認為PCT在細菌感染（尤其是菌血癥或敗血癥）早期診斷方面具有很高的應(yīng)用價值。

肝臟中的網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞（Kupffer細胞，KC），占全身單核吞噬細胞系統(tǒng)的80%－90%，是機體防御細菌感染的一道重要防線。當菌血癥發(fā)生時，進入血液的細菌途經(jīng)肝臟，可被kupffer細胞清除。細菌的LPS被KC識別后，激活KC釋放大量的化學(xué)物質(zhì)（TNF、白介素B4和補體C5）和毒性介質(zhì)（血小板活化因子、NO 和內(nèi)皮素－1），可對肝臟造成損傷［10］。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)，在感染發(fā)生時，ALT、AST、GGT等水平均顯著增高，而TP和ALB則呈現(xiàn)顯著降低的趨勢。表明肝臟在清除細菌時，產(chǎn)生的炎性介質(zhì)對其造成了一定的損傷。

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