紫杉醇聯(lián)合放療對鼻咽癌CNE細(xì)胞株凋亡蛋白表達(dá)的影響

楊永凈，劉士新，刁建東，曹 玲，柳群麗

（1.吉林省腫瘤醫(yī)院 放療一科，吉林 長春130012；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 腫瘤血液科）

鼻咽癌是我國常見的惡性腫瘤之一，在頭頸部惡性腫瘤中占首位。放射治療是鼻咽癌的主要治療手段，早期病人單純放療效果較好，但因其發(fā)生部位隱蔽，癥狀多樣性，就診病人70%為局部晚期病人，單純放療療效較差，局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移為常見的失敗原因。為提高局部晚期鼻咽癌的治療效果，局部放療和全身化療相結(jié)合成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)紫杉醇可使細(xì)胞周期阻滯于G2／M 期，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞再氧合，而處于G2／M期的腫瘤細(xì)胞對放療敏感。本研究應(yīng)用紫杉醇聯(lián)合放療對鼻咽癌CNE細(xì)胞株凋亡蛋白表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討紫杉醇對鼻咽癌細(xì)胞放療增敏作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株、藥物和試劑

人鼻咽癌CNE細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，紫杉醇為山西普德公司產(chǎn)品。噻唑藍(lán)（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）購自Sigma公司，RPMI－1640、胰蛋白酶購自GIBCO公司，胎牛血清購自天津TBD公司。

1.2 細(xì)胞及培養(yǎng)條件

人鼻咽癌細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的PRMI－640培養(yǎng)基中，37℃，5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞總蛋白的提取

將對數(shù)生長期的鼻咽癌CNE細(xì)胞隨機(jī)分為四組：空白對照組（不進(jìn)行任何處理，給予等體積PBS）；放療組（細(xì)胞以6Gy劑量進(jìn)行照射）；紫杉醇組（細(xì)胞加入亞細(xì)胞毒劑量紫杉醇）；放療聯(lián)合紫杉醇組（細(xì)胞加入亞細(xì)胞毒劑量紫杉醇后，以6Gy劑量進(jìn)行照射），將分組后的細(xì)胞株培養(yǎng)24h后，冷PBS洗滌2次，加入預(yù)冷的蛋白裂解液100μl，置于4℃搖床，溫和振蕩15min，14 000rpm，4℃離心15 min，取上清為全蛋白提取物。

1.4 BCA法蛋白定量

根據(jù)樣品數(shù)量，按50體積BCA試劑A加1體積BCA試劑B（50∶1）配制適量BCA工作液，充分混勻；以BSA作為標(biāo)準(zhǔn)品，配制不同濃度（2000、1000、750、500、250、125、62.5、31.25μg／μl）標(biāo)準(zhǔn)溶液，各取10μl置于EP管中；取不同轉(zhuǎn)染組蛋白提取物各10μl，至于不同EP管中；各管加入200μl BCA工作液；各管充分混勻，37℃放置30min，然后在562nm下比色測定；以BSA蛋白含量（μg）為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線；根據(jù)所測樣品的吸光值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相應(yīng)的蛋白含量（μg）；按相同蛋白濃度，分裝蛋白，－70℃保存。

1.5 SDS－PAGE

分別取上述分離總蛋白按4∶1比例加入5×SDS樣品緩沖液，混勻后，煮沸3－5min；取出樣品，冷卻至室溫后，離心（10 000rpm）30s，取上清每孔加樣30μl；40V電泳至濃縮膠與分離膠交界處，調(diào)整電壓到100V，恒壓電泳至分離膠底部。

1.6 轉(zhuǎn)膜

剪6塊3mm濾紙和一塊PVDF膜，大小與膠相同；將剪好的膜在100%甲醇中短暫浸泡后，再在電轉(zhuǎn)印緩沖液中浸泡平衡10－15min；濾紙用電轉(zhuǎn)液浸泡；待電泳結(jié)束后，取下凝膠，切去積層膠作標(biāo)記，電轉(zhuǎn)緩沖液漂洗膠并平衡20min。然后按以下順序安裝：陽極側(cè)－海綿－3張濾紙－NC膜－凝膠－3張濾紙－海綿－陰極側(cè)。放置每一層時，均要去除各層間的氣泡，以免影響轉(zhuǎn)移效果；用塑料支架夾緊上述各層，置于轉(zhuǎn)移電泳儀內(nèi)，以恒流200mA轉(zhuǎn)移2h；轉(zhuǎn)移結(jié)束后，取下PVDF膜，用鉛筆在膜的上緣作好標(biāo)記。將膜置于平皿中，加入TBST室溫漂洗10 min。

1.7 免疫結(jié)合

封閉：將上述PVDF膜放于平皿中，加入20ml封閉液（5%脫脂奶粉），室溫輕輕振蕩1h；TBST室溫漂洗2次，5－10min／次；用抗體稀釋液稀（含5%脫脂奶粉的TBST）釋一抗（鼠抗人caspase3抗體、鼠抗人NF－κB抗體）至1∶500；封閉結(jié)束后，PVDF膜放入一雜交袋中，按0.1ml抗體溶液／cm2膜加入抗體，去除氣泡，封口，4℃過夜；一抗中取出，TBST漂洗，10min／次，3－5次；用抗體稀釋液稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體至1∶5000，加入雜交袋中，室溫振蕩1－2h；TBST 漂洗，10min／次，3－5次。

1.8 曝光成像

配制ECL發(fā)光工作液；取出洗滌的PVDF膜，在濾紙上瀝干洗液，然后將膜完全浸入并與發(fā)光工作液充分接觸，室溫孵育1min；瀝干發(fā)光工作液，放入X光片暗盒內(nèi)曝光；顯影沖洗。

2 結(jié)果

放療組、紫杉醇組和放療聯(lián)合紫杉醇組caspase3表達(dá)高于空白對照組，放療聯(lián)合紫杉醇組組升高明顯。與此相對應(yīng)，放療組、紫杉醇組、放療聯(lián)合紫杉醇組NF－κB表達(dá)下降，其中放療聯(lián)合紫杉醇組降低顯著，說明放療對鼻咽癌細(xì)胞的殺傷作用是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來實(shí)現(xiàn)的，而小劑量的紫杉醇增強(qiáng)了對細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。見圖1，2。

圖1 鼻咽癌CNE細(xì)胞株caspase3蛋白免疫印跡分析

圖2 鼻咽癌CNE細(xì)胞株NF－κB蛋白免疫印跡分析

3 討論

局部晚期鼻咽癌治療失敗的主要原因是局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，目前國內(nèi)外多項(xiàng)研究報(bào)道誘導(dǎo)化療與輔助化療對降低局部晚期鼻咽癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和提高局部晚期鼻咽癌總生存率沒有實(shí)質(zhì)性的改善。同期放化療不但增加局部療效且可以減少或消滅遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，治療局部晚期鼻咽癌的效果較好，能夠提高局部晚期鼻咽癌的生存率已成共識［1，2］。

紫杉醇是一種新型的微管穩(wěn)定劑，具有獨(dú)特抗癌活性，能加快微管蛋白聚合，延緩微管解聚，形成穩(wěn)定的非功能性的微管束，從而破壞有絲分裂和細(xì)胞增殖。研究表明其不但能殺滅腫瘤細(xì)胞，控制微小的亞臨床轉(zhuǎn)移灶，降低遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的發(fā)生率，同時可作為放射增敏劑提高腫瘤的放射敏感性，與放療具有協(xié)同作用［3］。劉君等［4］用低濃度（4 ×102mmol／L）的紫杉醇作用于喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株Hep22 12 h或24h后再給予2Gy劑量（直線加速器）進(jìn)行照射比單純放療或單用紫杉醇能更明顯地抑制細(xì)胞的生長，而單獨(dú)使用2Gy劑量的照射并不能顯著抑制細(xì)胞的生長，初步說明了紫杉醇能起到放療增敏的作用。

本研究前期結(jié)果表明紫杉醇聯(lián)合放療組腫瘤抑制率明顯高于放療組及紫杉醇組，流式細(xì)胞檢測紫杉醇可將細(xì)胞周期阻滯于G2／M 期，顯著阻滯了細(xì)胞的周期進(jìn)展，從而增強(qiáng)了抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用。除上述機(jī)制外，本研究結(jié)果表明紫杉醇聯(lián)合放療可影響凋亡蛋白Caspase－3、NF－κB的表達(dá)，從而促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞凋亡。Caspase蛋白酶家族是細(xì)胞凋亡的中心環(huán)節(jié)，Caspase－3在細(xì)胞中以酶原方式存在，凋亡信號激活上游Caspase進(jìn)而激活下游Caspase－3，在凋亡執(zhí)行階段由下游Caspase－3對特定的底物進(jìn)行切割，激活核纖層蛋白、肌動蛋白等蛋白酶及核酸內(nèi)切酶等，抑制DNA修復(fù)酶從而破壞細(xì)胞骨架蛋白和核蛋白，使染色體斷裂成小片段，這些不可逆轉(zhuǎn)的改變導(dǎo)致細(xì)胞死亡［5］。Caspase－3是細(xì)胞凋亡信號中最關(guān)鍵因子之一，在Caspase－3家族的級聯(lián)反應(yīng)中，最后均通過激活Caspase－3使細(xì)胞進(jìn)入凋亡。NF－κB是一種能與免疫球蛋白κ輕鏈基因增強(qiáng)子κB序列特異結(jié)合并調(diào)節(jié)κ輕鏈轉(zhuǎn)錄的核蛋白因子，NF－κB在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用，NF－κB的活性不僅參與了淋巴瘤和骨髓瘤的發(fā)生，也存在于多種實(shí)體瘤中［6］。實(shí)驗(yàn)證明化療藥物引起NF－κB活化能抑制細(xì)胞死亡，是腫瘤臨床治療中耐藥性產(chǎn)生的關(guān)鍵因素［7］。NF－κB活化可抑制細(xì)胞死亡，因此NF－κB被認(rèn)為是抗凋亡因子，大量的研究結(jié)果表明抑制NF－κB活性可以誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡或使細(xì)胞恢復(fù)凋亡現(xiàn)象［8］。

本研究結(jié)果表明紫杉醇組、放療組及紫杉醇聯(lián)合放療組鼻咽癌CNE細(xì)胞株Caspase－3表達(dá)均較對照組增加，NF－κB表達(dá)均較對照組下降，尤以紫杉醇聯(lián)合放療組為著，提示紫杉醇影響凋亡蛋白的表達(dá)可能是其放療增敏作用的機(jī)制之一。

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