無機汞誘導人小細胞肺癌NCI＿H446細胞凋亡的分子機制研究

李 丹，于 蕾，袁海波，丁 會＊

（1.吉林大學第一醫院 呼吸科，吉林 長春130021；2.吉林大學白求恩醫學院 生理學系）

本研究在發現有機汞具有多途徑抗癌效應的基礎上［1，2］，進一步探討無機汞對小細胞肺癌（SCLC）細胞系NCI－H446細胞凋亡、凋亡相關基因mRNA轉錄水平和蛋白質表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人小細胞肺癌細胞株（NCI－H446）由吉林省腫瘤醫院腫瘤研究所贈送。無機汞（IM）（德國，Merck公司），As2O3（美國，Alfar Aesar公司），順鉑（DDP）（山東齊魯藥廠）；DMEM細胞培養基（美國，Gibco公司）；TrizolRNA提取試劑盒（上海生物工程公司）；Taq DNA polymerase（大連寶生物工程公司）；AMV逆轉錄酶（美國，Sigma公司）；Rnasin RNA酶抑制劑（美國，Promega公司）；間隔100bp DNA分子量標尺，Oligo dT寡核苷酸T（大連寶生物工程公司）。

1.2 主要儀器 550型酶標儀，凝膠成像分析系統（美國，Bio－Rad公 司）；PCR 擴 增 儀 （美 國，PE 公司）；FACSAN流式細胞儀（美國，BD公司）。

1.3 方法

1.3.1 細胞 取對數生長期 NCI－H446細胞，用0.25%胰酶消化，配制成單細胞懸液，調細胞濃度為1×106／ml，接種至6孔培養板（5×105／孔）。細胞分為IM組、As2O3組、DDP組和對照組。待細胞完全貼壁以后，IM組每孔加入終濃度為5.0μmol／L的IM，終體積均為2.0ml；As2O3組、DDP組和對照組分別加入As2O3、DDP及培養液，終體積為2.0 ml。培養6、12、24、48h后，分別收集細胞。

1.3.2 RT－PCR Trizol法提取細胞總RNA 經紫外分光光度計檢測RNA純度良好后，RNA在AMV逆轉錄酶作用下合成cDNA。再以cDNA作為模板參與完成PCR反應。PCR擴增的條件為：94℃1min，57℃1min，72℃90s，35個循環，最后1次循環結束后，72℃延伸10min。根據基因cDNA序列設計 Bcl－2、Bax、Caspase－3和β－actin的 PCR引物（由上海生物工程公司合成）。Bcl－2引物序列：正向5′CGCTCTGTGGATGACTGAGT3′，反向5′GATTTGACCATTTGCCTGAAT3′，產 物 長 度389bp。Bax引物序列：正向5′ATTGGAGATGAACTGGATAGC3′，反向5′CCACAAAGATGGTCACTG3′，產物長度337bp［3］。Caspase－3引物序 列：正 向 5′GCACTGGAAT－GTCAGCTCGCAA3′， 反 向 5′ GCCACCTTCCGGTTAACACGAC3，產物長度556bp［4］。β－actin引物序列：正向5′TCTGGATCACCTTCTGCTGG3′，反向5′ATTGCTCAGGA－CATTTCTG3′，產 物 長 度 690 bp［5］。PCR產物在1%瓊脂糖凝膠電泳后經凝膠成像系統分析結果。目的基因的表達水平用其與GAPDH相比較的相對平均灰度值表示。

1.3.3 Western Blot NCI－H446細胞總蛋白的提取及定量 不同濃度（0、2.5、5、10及20μM）IM 處理NCI－H446細胞24h后，分別收集細胞，提取總蛋白。于595nm處測定光吸收值，由標準曲線查出待測樣品濃度。經電泳、轉膜、免疫反應，經膠片顯影，測積分光密度值，分析結果。

2 結果

2.1 流式細胞術（FCM）檢測細胞凋亡的變化 不同濃度（1.25、2.5、5、10及20μM）IM、As2O3和DDP作用NCI－H446細胞24h后，隨著劑量的升高可以看到凋亡率有增加的趨勢，其中，IM組在濃度小于5.0μM時，早期凋亡率隨藥物濃度的增加而增高，于5.0μM達到峰值75.28%，IM的濃度超過5.0μM后，早期凋亡率隨藥物濃度的增加而呈現下降趨勢，而晚期凋亡和壞死率逐漸增多。As2O3和DDP也有同樣的規律，但其使細胞達到早期凋亡峰值的濃度是10.0μM，且早期凋亡率的峰值在As2O3組為56.87%，DDP組為61.20%，均低于IM（P＜0.001或0.01），其中DDP比 As2O3略高，但無統計學差異。結果見表1－3及圖1。

表1 IM作用NCI－H44624h后對細胞凋亡的影響（n＝3，，η%）

表1 IM作用NCI－H44624h后對細胞凋亡的影響（n＝3，，η%）

注：與上一劑量組比較 ＊P＜0.001；▲P＜0.05；□P＜0.01

Late apoptosis Early apoptosis Normal cell Necrotic cell（%）IM（μM）0.0 5.34±0.35 0.09±0.01 94.00±2.1 0.57±0.05 1.25 40.14±1.72＊ 0.69±0.03＊ 55.50±1.68 1.72±0.85 2.5 61.91±2.13＊ 3.85±1.12▲ 32.80±1.68 1.40±0.11 5.0 75.28±1.86＊ 3.79±0.92 19.34±1.13 2.08±0.45 10.0 51.46±2.37 30.84±2.25＊ 12.98±1.59 5.47±1.18▲20.0 18.57±1.06 34.96±1.60□ 1.49±2.26 44.96±2.16＊

表2 As2O3作用NCI－H44624h后對細胞凋亡的影響（n＝3，，η%）

表2 As2O3作用NCI－H44624h后對細胞凋亡的影響（n＝3，，η%）

注：與上一劑量組比較 ＊P＜0.001，▲P＜0.05，▽P＜0.01

As2O3（μM）Early apoptosis Late apoptosis Normal cell Necrotic cell（%）0.0 5.34±0.35 0.09±0.01 94.00±2.1 0.57±0.05 1.25 31.12±2.55＊ 2.52±0.13＊ 65.27±2.34 1.32±0.11▲2.5 42.14±1.14＊ 5.68±1.74 51.08±2.24 2.48±0.13▲5.0 44.98±1.99＊ 4.85±1.72 47.98±2.56 1.89±0.07 10.0 56.87±2.34＊ 8.64±1.21＊ 24.97±1.65 10.78±1.12＊20.0 31.02±1.16 35.13±2.45▽ 5.23±2.75 30.10±1.23＊

表3 DDP作用NCI－H44624h后對細胞凋亡的影響（n＝3，，η%）

表3 DDP作用NCI－H44624h后對細胞凋亡的影響（n＝3，，η%）

注：與上一劑量組比較 ＊P＜0.001；▲P＜0.05

DDP（μM）Early apoptosis Late apoptosis Normal cell Necrotic cell（%）0 5.34±0.35 0.09±0.01 94.00±2.1 0.57±0.05 1.25 29.15±1.97＊ 2.62±1.02 67.32±2.56 21.25±1.62＊2.5 42.45±2.11＊ 5.16±2.34 48.47±2.21 4.79±1.83 5.0 48.78±2.67＊ 7.76±2.23 33.45±2.74 11.32±1.56▲10.0 61.20±2.21＊ 10.84±1.23 18.75±1.18 11.04±1.38 20.0 21.02±1.78 37.86±2.11＊ 3.16±0.09 38.27±1.69＊

圖1 IM、As2O3、DDP 作用 NCI－H446 24h后對早期細胞凋亡的影響

2.2 細胞凋亡相關基因轉錄水平的變化 采用RT－PCR方法檢測5μM IM作用NCI－H446細胞6－48h后Bax mRNA水平的變化。結果顯示：IM組細胞Bax mRNA及Caspase－3mRNA水平高于對照組（P＜0.001），存在著時間依賴性增高趨勢，至24h達到最高；而Bcl－2mRNA水平低于對照組（P＜0.001），存在著時間依賴性降低趨勢，至24h達到最低。結果見表4。

表4 經5μmol／L IM處理后不同時間點NCI－H446細胞中Bax、Bcl－2及 Caspase－3mRNA 水 平 與 β－actin水 平 的比值（n＝3，）

表4 經5μmol／L IM處理后不同時間點NCI－H446細胞中Bax、Bcl－2及 Caspase－3mRNA 水 平 與 β－actin水 平 的比值（n＝3，）

＊P＜0.001vs control group

Time（h） Bax mRNA Bcl－2mRNA Caspase－3mRNA 0 0.55±0.010 1.40±0.024 0.47±0.025 6 0.85±0.028＊ 1.19±0.020＊ 0.66±0.035＊12 1.14±0.059＊ 1.10±0.018＊ 1.22±0.080＊24 1.66±0.030＊ 0.95±0.021＊ 1.42±0.025＊48 0.69±0.023＊ 0.91±0.014＊ 1.09±0.013＊

2.3 Western Blot法檢測 Bcl－2、Bax、Caspase－3蛋白水平變化 采用Western Blot法檢測不同濃度（0、1.25、2.5、5及10μM）IM 作用 NCI－H446 24h后，細胞凋亡抑制基因Bcl－2、凋亡促進基因Bax、Caspase－3蛋白水平變化。結果顯示：IM各濃度組細胞Bcl－2蛋白水平均低于對照組，且存在著濃度依賴性降低趨勢；IM各濃度組細胞Bax蛋白水平均高于對照組，且存在著濃度依賴性增高趨勢；各組均可見32kDa的Caspase－3蛋白酶原表達，各實驗組在17kDa處可見一裂解的小片段，并隨劑量的加大顏色逐漸加深，對照組未檢測到17kDa的小片段，表明在IM的作用下Caspase－3蛋白酶原被剪切活化。

3 討論

本實驗選擇有開發潛力的IM作為研究對象，選擇療效肯定的順鉑（DDP）和同樣具有劇毒的三氧As2O3為對照，探討IM誘導細胞凋亡的作用及機制。結果表明，IM誘導小細胞肺癌細胞凋亡與As2O3和DDP有同樣療效，且有較低使用濃度和高的早期凋亡率。理想抗癌藥就是以最小的劑量產生最大的療效，誘導細胞產生凋亡而不是壞死。因此IM具備這樣的條件，可能成為最有開發潛力的抗癌藥物之一。楊惠芬等［6］通過比較氯化汞（HgC12）和As2O3的誘導凋亡作用也證實，汞的誘導凋亡和殺死細胞能力強于砷。哈爾濱醫科大學最早生產的癌靈1號（713注射液）以As2O3和HgC12為主要成份。1990年后，因為HgC12不易溶于水，且測不出其濃度，所以不再加入制劑中。然而，去HgC12后，抗癌作用減弱。

細胞凋亡是一個復雜、精密的過程，在諸多調控凋亡的信號轉導途徑中，線粒體跨膜電位崩解是細胞凋亡特異性早期指標之一，這是由于其通透性轉換孔（permeability transition pore，PTP）開放引起線粒體通透性轉換的直接后果。本研究檢測了調控PTP開放和關閉的兩個關鍵基因Bcl－2和Bax在mRNA及蛋白水平的變化，顯示IM組細胞凋亡抑制基因Bcl－2mRNA及蛋白表達水平均低于對照組，而凋亡促進基因Bax mRNA及蛋白表達水平均高于對照組。說明IM在上述基因的轉錄翻譯過程中有重要調控作用。Bax相對量高于Bcl－2，Bax同二聚體的數量增多，促進了PTP的開放，啟動了細胞凋亡的線粒體途徑，加速了細胞凋亡［7］。此外，蛋白酶家族Caspase在凋亡程序的啟動及執行過程中發揮了非常重要的作用。故本實驗檢測了最具代表性的 Caspase－3蛋白水平的變化，顯示IM 組Caspase－3mRNA水平高于對照組，說明IM在轉錄水平調控了該基因的表達；Western blot結果顯示隨著濃度的增加，凋亡的進展，活性酶亞基P17的產生愈來愈多，說明IM可使翻譯后酶前體活化，即IM在雙重水平上調控了Caspase－3。當濃度達到10μmol／L時，活性酶亞基P17卻呈下降趨勢，這是因為壞死細胞增加，使 Caspase－3的活性下降［8］。上述實驗結果說明IM誘導NCI－H446細胞凋亡是通過調控凋亡相關基因表達實現的。它下調Bcl－2表達、上調Bax表達，使得Bcl－2／Bax比例降低，使得PTP孔不可逆的開放，線粒體膜外的小分子可以進入到膜內，使線粒體膜電位消失，外膜破壞，經系列反應進而活化Caspase－3，使其不能修復損傷的DNA，進而細胞發生凋亡。

綜上所述，IM在誘導細胞凋亡方面與As2O3和DDP作用相同，但在同等劑量下，IM作用強于后兩者，如果結合它的揮發性，則將是吸入治療中心型肺癌的理想用藥，故IM可能成為最有開發潛力的抗癌藥物之一。

［1］劉秀花，費秉元，袁長吉，等.甲基汞＿L＿半胱氨酸共軛物誘導惡性腦膠質瘤凋亡的體外研究［J］.中國實驗診斷學，2012，16（4）：579.

［2］丁 會，許力軍，李 丹.氯化甲基汞對小細胞肺癌NCI.H446細胞的增殖抑制作用［J］.中國免疫學雜志，2009，25（12）：1085.

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［6］楊惠芬，李明勛，張 鵬.氯化汞、三氧化二砷及阿糖胞苷對K562和 HEL細胞株作用的比較［J］.臨床血液學雜志，2003，16（5）：243.

［7］Thornberry NA，Lazebnik Y.Caspases：Enemies within［J］.Science，1998，281 （5381）：1312.

［8］Oliver F J，de la Rubia G，Rolli V，et al.Importance of poly（ADP－ri－bose）polymerase and its cleavage in apoptosis.Lesson from an uncleavablemutant［J］.J Biol Chem，1998，273（50）：335.