慢病毒介導的RNA干擾增殖誘導配體基因抑制胃癌細胞增殖

蒿姍姍，李 薇，王 暢，崔久嵬

（吉林大學第一醫院 腫瘤中心，吉林 長春130021）

胃癌（GC）是世界第二大致癌癥相關死亡的最常見的原因之一，也是我國最常見的惡行腫瘤之一。近年來，胃癌的發病呈上升趨勢，探討其發病機制對其診治具有重要意義。

增 殖 誘 導 配 體 （APRIL）（又 稱 TALL－2，TRDL1，或TNFSF13）是腫瘤壞死因子（TNF）家族的一個成員。它最初確定是1998年由Hahne等［1］首先發現，因刺激腫瘤細胞的增殖而得名。APRIL在正常組織的表達很弱，但在多種腫瘤細胞和組織，如肺癌、黑色素瘤［2］，特別是胃腸道腫瘤有高水平表達［1，3］。在本項研究中，我們通過構建 APRIL siRNA慢病毒載體并轉染人胃癌MGC803細胞，觀察其對MGC803細胞增殖及細胞周期的影響，以探討其在胃癌發病中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

人胃癌細胞系 MGC803（購自ATCC）；大腸桿菌菌株DH5α、293T細胞（本實驗室保存）；RPMI 1640培養液、胎牛血清（Gibco公司）；M－MLV逆轉錄酶（Promega公司）；Lipofectamine 2000、Trizol試劑盒（Invitrogen公司）；限制性內切酶、PCR試劑盒 （TaKaRa公 司）；MTT、核 糖 核 酸 酶 （Sigma－Aldrich公司）；慢病毒載體pLVTHM、psPAX2、pMD2.G（均購自Biovector Science Lab）。

1.2 方法

1.2.1 APRIL siRNA慢病毒載體質粒的設計與構建 根據人APRIL基因mRNA序列（NCBI Reference Sequence：NM＿172088.1），通過siRNA“Target Finder Tool”設計軟件（GenScrip公司網站提供）設計針對目的基因ARPIL的干擾序列：5’－aaTCCAGGATGCTGGAGTTTA－3’，同時設計陰性 對 照 序 列 （nonsilencing，NS）：5’－TTCTCCGAACGTGTCACGT－3’。通 過 BLAST 同 源 性分析，排除了干擾序列非特異性抑制其他基因序列的可能。用化學合成法合成DNA寡核苷酸，退火，并插入到包含綠色熒光蛋白（GFP）的慢病毒載體pLVTHM中，最后將連接產物轉化到大腸桿菌DH5α感受態細胞，涂布平板，37℃過夜培養。對長出的單克隆菌落進行PCR鑒定，并通過限制性內切酶分析及DNA測序鑒定。

1.2.2 細胞培養與慢病毒的制備與轉染 人胃癌細胞MGC803和293T細胞，于含有10%胎牛血清、100U／ml青霉素和100mg／ml鏈霉素的RPMI 1640培養基，37℃，5%CO2飽和濕度培養箱內孵育。按Lipofectamine 2000使用說明，將重組的慢病毒質粒與輔助載體共轉染293T細胞。轉染48h后，收集含有APRIL siRNA和非特異性序列的siRNA慢病毒顆粒的細胞上清液，然后確定此病毒的滴度。測得MGC803細胞在重組慢病毒轉染3天后的感染復數（MOI）為20。

1.2.3 RT－PCR 檢測 APRIL mRNA 的表達 應用Trizol試劑盒，按照試劑盒說明書對MGC803細胞提取總RNA。根據說明書，加入M－MLV逆轉錄酶42℃，反應60min。APRIL mRNA的表達通過SYBR green PCR master mix分析，反應如下：95℃15s，95℃5s，45個循環，60℃30s。引物設計如下：APRIL正義鏈：5＇－GGTATCCCTGGCAGAGTC－3＇；反義鏈：5＇－CTGTCACATCGGAGTCATC－3’和humanβ－actin：正 義 鏈：5＇－GGCGGCACCACCATGTACCCT－3＇；反 義 鏈：5＇－AGGGGCCGGACTCGTCATACT－3＇。以管家基因β－actin APRIL的循環閾值為標準對照，測定APRIL的表達。所有實驗均重復3次。

1.2.4 MTT比色法檢測細胞增殖 取Lenti－siAPRIL和Lenti－NS轉染的胃癌細胞，分別接種于96孔培養板，每孔100μl（含細胞數為2 000），每組均設3個復孔。于CO2培養箱中培養至第1，2，3，4和第5天后，各孔分別加入20μl（5mg／ml）的MTT，繼續孵育4h。吸棄培養上清，加入150μl二甲基亞砜（DMSO），充分混合10min，用酶標儀于570nm處測定OD值。計算各組3個復孔的平均值，繪制計算細胞生長曲線。

1.2.5 流式細胞儀分析細胞周期變化 收集轉染效率在80%以上的細胞，用D－Hanks液清洗，70%的預冷乙醇固定，4℃，1h。PBS洗滌2次，加入50 μg／ml的PI和100μg／ml的 RNase，室溫，避光5 min后，用流式細胞儀測定，實驗重復3次。

1.2.6 統計分析 采用SPSS13.0軟件，組間比較用方差分析，P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 熒光顯微鏡觀察重組慢病毒轉染的效率

重組慢病毒轉染MGC803細胞72h后，通過熒光顯微鏡可觀察轉染成功的細胞，在470－490 nm光激發下發出綠色熒光（圖1）。轉染效率超過90%，說明慢病毒包裝成功，且轉染效率較高。

圖1 熒光顯微鏡觀察重組慢病毒轉染的效率

2.2 Lenti－siAPRIL對APRIL基因表達的影響

本研究對非特異序列載體轉染組和Lenti－siAPRIL的APRIL mRNA表達水平進行了檢測。如圖2所示：Lenti－siAPRIL轉染MGC803細胞的APRIL mRNA水平均顯著減少68.1%（P＜0.01）。

2.3 Lenti－siAPRIL對細胞增殖的影響

Lenti－siAPRIL轉染的 MGC803細胞與Lenti－NS轉染的細胞分別在第2，3，4和5天后檢測細胞增殖情況。細胞生長曲線顯示（圖3）：與Lenti－NS組相比，Lenti－siAPRIL轉染細胞組的增殖能力明顯下降（P＜0.05）

圖2 RT－PCR對APRIL基因干擾效果的檢測

圖3 MTT實驗檢測細胞增殖

2.4 Lenti－siAPRIL對細胞周期的影響

我們對 Lenti－NS轉染組和 Lenti－siAPRIL 轉染組轉染3d后進行了流式細胞儀細胞周期檢測，結果如圖4所示。在圖4中，與對照組相比，Lenti－siAPRIL組的細胞在S期和G2／M期細胞周期階段的百分比增加；而在G0／G1期細胞比例顯著降低。提示Lenti－siAPRIL組胃癌細胞增殖被阻滯在G2／M期。

圖4 流式細胞儀檢測細胞周期

3 討論

目前，胃癌仍然是威脅人類健康的重要殺手，在缺乏對胃癌的早期診斷和檢測策略的情況下，胃癌的預后仍然較差［4］。在癌癥發展過程中，基因異常經常可以監測到，例如：基因突變或者參與腫瘤的生存、發展和轉移的基因擴增。對于胃癌，一系列特定基因（癌基因和抑癌基因）突變已被發現，其中包括APRIL 基因［5］。

APRIL作為腫瘤壞死因子（TNF）家族的新成員，它在動物模型中顯示出促進腫瘤增殖的作用，例如：APRIL過度表達誘導B細胞淋巴瘤［6］。然而，APRIL促進腫瘤增殖并不局限于B細胞淋巴瘤。事實上，APRIL對實體瘤也提供生存／增殖信號。雖然并未在體外檢測到，但這種APRIL在腫瘤細胞過表達的現象，已在體內觀察到［7－9］。

RNA干涉（RNAi）是雙鏈 RNA（double－stranded RNA，dsRNA）引發的轉錄后基因沉默。以某個基因為靶標的dsRNA被導入宿主細胞，可以使其mRNA發生特異性降解，導致相應的基因沉默［10］。慢病毒是一種逆轉錄病毒，其最大的特點是轉染分裂期細胞的同時，還可以轉染非分裂期細胞，并可在宿主體內長期表達［11］。

在這項研究中，實驗結果表明，我們構建的Lenti－siAPRIL慢病毒質粒能有效地轉染人胃癌MGC803細胞。與非特異序列轉染組相比，LentisiAPRIL組顯著抑制了APRILmRNA表達；同時，Lenti－siAPRIL能抑制細胞增殖，提示：APRIL可調節GC細胞的增殖。此外，APRIL基因的沉默導致在S期和G2／M期細胞比例顯著增加，這表明，APRIL siRNA抑制細胞增殖，通過將細胞阻滯在G2／M期。APRIL通過調節細胞周期發揮其作用，這種調節作用的進一步研究，將有助于我們更好地理解胃癌的分子機制。

綜上所述，我們成功構建了人APRIL慢病毒siRNA干擾載體，且驗證了慢病毒介導的RNA干擾能夠有效抑制APRIL的表達。慢病毒介導的siRNA有效地抑制細胞增殖，且細胞周期被阻滯在G2／M期。該研究對后繼的APRIL基因為靶點的胃癌的治療研究奠定了基礎。

［1］Hahne M，Kataoka T，Schroter M，et al.APRIL，a new ligand of the tumor necrosis factor family，stimulates tumor cell growth［J］.J Exp Med，1998，188（6）：1185.

［2］Yaccoby S，Pennisi A，Li X，et al.Atacicept（TACI－Ig）inhibits growth of TACI（high）primary myeloma cells in SCID－hu mice and in coculture with osteoclasts［J］.Leukemia，2008，22（2）：409.

［3］Kelly K，Manos E，Jensen G，et al.APRIL／TRDL－1，a tumor necrosis factor－like ligand，stimulates cell death［J］.Cancer Res，2000，60（4）：1026.

［4］Resende C，Ristimaki A，Machado JC.Genetic and epigenetic alteration in gastric carcinogenesis［J］.Helicobacter，2010，15（1）：35.

［5］Chiu A，Xu W，He B，et al.Hodgkin lymphoma cells express TACI and BCMA receptors and generate survival and proliferation signals in response to BAFF and APRIL［J］.Blood，2007，109（2）：737.

［6］Chu VT，Enghard P，Riemekasten G，et al.In vitro and in vivo activation induces BAFF and APRIL expression in B cells［J］.J Immunol，2007，179（9）：5956.

［7］Mhawech－Fauceglia P，AllaAl，Odunsi K，et al.Role of the tumour necrosis family ligand APRIL in solid tumour development：Retrospective studies in bladder，ovarian and head and neck carcinomas［J］.European journal of cancer，2008，44（15）：2099.

［8］Wang F，Ding W，Wang J，et al.Identification of microRNA－target interaction in APRIL－knockdown colorectal cancer cells［J］Cancer Gene Therapy，2011，18（7）：507.

［9］Roosnek E，Burjanadze M，Dietrich PY，et al.Tumors that look for their springtime in APRIL［J］.Crit Rev Oncol Hematol，2009，72（2）：95.

［10］Romano G.Current development of lentivial－mediated gene transfer［J］.Drug News Perspect，2005，18（2）：132.

［11］Fish RJ，Kruithof EK.Short－term cytotoxic effects and longterm instability of RNAi delivered using lentiviral vectors［J］.BMC Mol Biol，2004，5：9.