骨髓間充質干細胞參與牙髓損傷修復的體內實驗研究

郝靖惠，楊 博，白慶霞，張 艷，劉曉靜，陸 群

(第四軍醫大學口腔醫學院，陜西西安 710032)

牙本質－牙髓復合體可適應各種刺激引發的防御反應，保存活力，而且其主要作用是分泌牙本質基質。牙齒發育完成后，牙髓仍通過內環境和自我保護機制起營養牙本質的作用，還能重新刺激牙本質生成來抵御外界傷害。牙髓的損傷修復取決于其受損程度，對于溫和的刺激，修復涉及一個簡單的成牙本質細胞生成牙本質活動的上調過程，即反應性牙本質生成過程;如遇到強烈的組織損傷，就會發生更復雜的防御修復反應，需要干/祖細胞的募集，分化為成牙本質樣細胞，并上調牙本質基質的分泌活動，即修復性牙本質的生成過程。雖然在此過程中所涉及的分子也參與發育過程，但其和發育不同的是沒有牙源性上皮與間充質相互作用的調節過程。對成牙本質細胞增殖分化的調節機制研究是將干細胞向臨床治療轉化的關鍵。

Gronthos等(2000)首先提出成人牙髓中存在具備自我更新和多向分化潛能的前體細胞—牙髓干細胞(dental pulp stem cells，DPSCs)，并證明其具有形成牙本質－牙髓樣復合體的能力，認為牙髓干細胞在牙本質－牙髓的損傷修復中具有非常重要的作用［1］。目前，關于牙髓損傷修復的研究僅局限于牙齒本身，當牙髓損傷時，牙髓干細胞可分化為成牙本質樣細胞，在損傷部位形成修復性牙本質而修復缺損，保護牙髓組織。然而，牙源性干細胞來源匱乏且擴增困難，而且牙齒是人體的器官之一，亦應考慮到其損傷后參與修復的全身性因素，如骨髓間充質干細胞，其具有自我更新及多向分化潛能，并在骨、軟骨、心臟、神經、皮膚等損傷中發揮重要作用［2－6］。當牙髓損傷時，機體內骨髓間充質干細胞是否參與修復及其在修復中的作用尚未見報道。因此尋找非牙源性的間充質干細胞向成牙本質細胞方向分化參與牙本質缺損的修復就顯得尤為重要。本研究利用GFP－BMMSCs嵌合SD大鼠牙本質缺損模型探討BMMSCs是否參與牙髓損傷的修復。

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器

GFP轉基因大鼠(第四軍醫大學組織工程中心提供);流式細胞儀(ELITEESP型，Beckman－Couher，美國);倒置熒光顯微鏡和照相系統(Olympus，日本);α－MEM 培養液(Gibco公司，美國);胎牛血清(Hyclone公司，美國);胰蛋白酶、Hoechst 33342(Sigma公司，美國);綠色熒光蛋白(GFP)多克隆抗體(Abcam，美國);FITC熒光二抗(Chemicon，美國)。

1.2 方法

1.2.1 GFP轉基因大鼠 BMMSCs的培養

取3周齡GFP轉基因大鼠2只，脫頸處死后750 mL/L乙醇浸泡10 min，無菌超凈臺內完整分離股骨、脛骨，剔凈軟組織，剪去骨骺端，5 mL一次性注射器吸取α－MEM培養液沖洗骨髓腔，沖出骨髓并轉移至離心管中，反復吹打成全骨髓細胞懸液，800 r/min離心5 min，棄去上清，α－MEM 培養液重懸，接種至75 cm2培養瓶中，37℃、50 mL/L CO2培養箱中常規培養。48 h后首次換液，當細胞達到80%匯合時，胰酶消化傳代。

1.2.2 GFP－BMMSCs嵌合 SD 大鼠模型的構建和構建后檢測方法

取8周齡SD大鼠10只，隨機抽取2只用于正常對照，其余8只用60Co－γ射線全身照射進行預處理，照射劑量為6 Gy。在照射完畢12 h后，24 h內經尾靜脈注射SD大鼠裂紅全骨髓細胞懸液與GFP大鼠骨髓間充質干細胞的混合液(1×108裂紅全骨髓細胞+2×106GFP大鼠骨髓間充質干細胞)0.5 mL。

細胞移植后30 d，分別取嵌合大鼠及正常組大鼠外周血，經紅細胞裂解后進行流式細胞術，檢測其單核細胞中熒光細胞的比例然后脫頸處死所有大鼠，取其骨髓間充質干細胞，體外培養約5 d，待細胞匯合達60%時，流式細胞術檢測骨髓間充質干細胞中熒光細胞所占的比例;同時取嵌合大鼠心臟、肝臟、腎臟，即刻送冰凍切片，Hoechest 33342襯染10 min，熒光顯微鏡下觀察并照相。

1.2.3 GFP－BMMSCs嵌合 SD 大鼠牙本質缺損模型的構建及HE和免疫熒光染色觀察

同上法制備9只GFP－BMMSCs嵌合大鼠，30 d后待移植的骨髓間充質干細胞完全嵌合，用10 g/L戊巴比妥鈉液(3 mL/kg)腹腔注射麻醉，仰臥固定。750 mL/L乙醇棉球擦拭消毒左側上頜磨牙區，用高速渦輪機和球鉆在左側上頜第一磨牙牙合面制造牙本質缺損，右側上頜第一磨牙不做任何處理用于對照，每個牙合面缺損深度均控制在0.5～1 mm，且未見穿髓點。術后常規飼養，分別于術后5、10、15 d各處死3只大鼠，即刻分離上頜骨，40 g/L多聚甲醛固定24 h，170 g/L EDTA脫鈣30 d，流水沖洗24 h后沿上頜第一磨牙矢狀方向制作5 μm冰凍切片和常規石蠟切片，分別進行免疫熒光和HE染色，熒光顯微鏡和顯微鏡下觀察并照相。

2 結果

2.1 GFP－BMMSCs嵌合大鼠模型的檢測指標

2.1.1 嵌合大鼠外周血單核細胞及骨髓間充質干細胞中熒光細胞的比例

GFP－BMMSCs嵌合大鼠模型構建后30 d，外周血單核細胞中熒光細胞比例為7.9%(圖1b)，而正常大鼠僅為0.3%(圖1a)，嵌合大鼠BMMSCs中熒光細胞的比例為33.4%(圖1d)，而正常大鼠僅為0.7%(圖1c)。

2.1.2 GFP－BMMSCs嵌合大鼠各臟器中熒光細胞的分布

嵌合大鼠心臟(圖2a～b)、肝臟(圖2c～d)、腎臟(圖2e～f)中均發現有少量綠色熒光細胞，且出現在毛細血管周圍。

2.2 GFP－BMMSCs嵌合SD大鼠牙本質缺損牙齒HE染色

正常對照組(圖3a)，牙髓組織由成牙本質細胞層、多細胞層和固有牙髓細胞構成，成牙本質細胞成柱狀排列在髓腔內壁。缺損5 d組(圖3b)，牙髓組織成牙本質細胞層部分壞死，牙髓小血管擴張，炎癥明顯，缺損部位所對應的髓腔內壁出現修復性牙本質。缺損10 d組(圖3c)，缺損對應的髓壁處出現大量狹長形態的細胞層，髓室內小血管增生。缺損15 d組(圖3d)，牙髓炎癥明顯減輕，缺損部位所對應的髓腔內壁出現修復性牙本質。

2.3 GFP－BMMSCs嵌合SD大鼠牙本質缺損牙齒免疫熒光染色

正常對照組(圖4a，b)髓腔內存在少量表達綠色熒光的細胞。缺損5 d組(圖4c，d)，髓腔內綠色熒光的細胞數量增加。缺損10 d組(圖4e，f)，髓腔內綠色熒光的細胞數量繼續增加，并分布在缺損所對應的髓壁。缺損15 d組(圖4g，h)，髓腔內綠色熒光細胞數量較10 d組減少。

圖1 流式細胞術結果

圖2 冰凍切片結果(×200)

圖3 HE染色結果

圖4 免疫熒光染色結果(×40)

3 討論

牙髓與牙本質在胚胎發生上聯系密切，對外界刺激有互聯效應，當牙本質缺損時，外界刺激必然會通過牙本質小管引起牙髓反應。當牙齒受到酸蝕、磨耗等進展緩慢的刺激，牙本質缺損程度較小時，成牙本質細胞合成分泌活動上調，分泌基質進而礦化形成反應性牙本質;而當牙齒受到牙折、深齲等強烈且進展快速的刺激，牙本質缺損程度較大時，會激發牙髓產生生物保護性反應為主的炎癥反應，牙髓組織中有分化潛能的干細胞或前體細胞會分化為新的成牙本質細胞，分泌大量的細胞外基質并礦化形成修復性牙本質［7］。

骨髓間充質干細胞是存在于骨髓中的一種多能成體干細胞，能夠自我更新，并具有多向分化的潛能［2］，被認為是組織工程中的重要種子細胞。Mikako等研究發現骨髓間充質干細胞可以修復皮膚缺損［6］;Beeres等利用骨髓間充質干細胞成功修復心肌損傷［8］;于金華等已觀察到BMMSCs具有形成牙本質－牙髓復合體樣結構的能力［9］。以上研究均為干細胞修復組織缺損方面積累了一定的經驗，也使得研究骨髓間充質干細胞對牙本質牙髓損傷進行修復成為牙齒損傷修復新的研究方向。綠色熒光蛋白(GFP)轉基因大鼠為干細胞示蹤提供了良好的動物來源，本課題組前期研究已經證明了GFP－BMMSCs體外擴增后持續穩定表達綠色熒光，并具有多向分化性，為后續實驗提供了良好的示蹤干細胞［10］。同時，體外實驗中已經證明:骨髓間充質干細胞在牙胚細胞條件培養液的誘導下，可分化為成牙本質樣細胞［11］。

以往利用GFP嵌合模型的研究中，有學者成功的觀察到GFP標記的骨髓細胞遷移到骨折損傷部位、腦梗塞損傷區以及腎炎損傷區［3，12－13］。本研究于細胞移植后30 d通過流式細胞術檢測GFP嵌合模型大鼠外周血單核細胞和骨髓間充質干細胞中熒光細胞的比例以及心臟、肝臟、腎臟等組織冰凍切片觀察到熒光細胞的分布，證實了通過尾靜脈注射的GFP－BMMSCs已嵌合至SD大鼠體內，且大部分細胞歸巢到骨髓。本實驗首次使用GFP－BMMSCs嵌合SD大鼠模型研究 BMMSCs在牙髓損傷修復中的作用，觀察到在未造牙本質缺損的對照組，也有少量的熒光細胞的分布，這可能是由于60Co射線的照射對大鼠各組織器官造成一定的損傷，而與此相比，在牙本質缺損組，有更多的GFP－BMMSCs可遷移到損傷的牙髓部位，上述結果表明骨髓間充質干細胞與牙髓牙本質修復密切相關，因此，可考慮通過增強骨髓細胞的遷移分化能力來發展干細胞在牙髓損傷中的治療。

本研究還發現在牙本質缺損15 d組，牙髓充血消失，牙髓組織已基本恢復正常，而熒光細胞的數量有所減少，推測可能是骨髓間充質干細胞修復損傷后又歸巢到骨髓或者逐漸凋亡，目前，關于骨髓間充質干細胞在修復損傷后的去向問題尚無報道，還有待于進一步研究。

在目前已有的研究中，關于骨髓間充質干細胞對組織損傷修復的機制有兩種不同的觀點:有學者認為骨髓間充質干細胞是通過分化為損傷部位的細胞而參與修復的［3，6］;另有學者則認為骨髓間充質干細胞是遷移到損傷部位通過分泌組織修復相關因子調節組織損傷處的炎癥而參與損傷的修復［15］。有鑒于此，我們將繼續利用 GFP－BMMSCs嵌合SD大鼠牙本質缺損模型來研究骨髓間充質干細胞修復牙髓損傷的具體機制。

已有研究證明:wnt信號通路在牙齒發育過程中起著重要作用。我們前期的體外研究也發現:經典wnt通路可能負向調節骨髓間充質干細胞向成牙本質樣細胞的分化。據此提出假說:當牙本質缺損程度較重，致牙髓損傷時，能否通過抑制wnt通路來增強骨髓間充質干細胞向成牙本質樣細胞的分化，從而促進牙本質－牙髓損傷的修復。故還將繼續利用GFP－BMMSCs嵌合大鼠牙本質缺損模型研究wnt通路對機體內骨髓間充質干細胞的遷移以及在牙髓損傷修復中的作用，以期通過調節經典wnt通路來促進牙本質－牙髓損傷的修復，為將來臨床治療較嚴重的牙本質缺損提供新的治療策略。

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