毛細(xì)管電泳法對(duì)乳及乳制品中乳源蛋白的研究

田 蘭，馬曉麗，陳春麗，孟 磊，李新霞

(新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院分析測(cè)試中心，新疆烏魯木齊830011)

毛細(xì)管電泳法對(duì)乳及乳制品中乳源蛋白的研究

田 蘭，馬曉麗，陳春麗，孟 磊，李新霞*

(新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院分析測(cè)試中心，新疆烏魯木齊830011)

采用毛細(xì)管電泳方法對(duì)原料乳、市售鮮奶、不同廠家的巴氏滅菌乳、不同廠家和產(chǎn)地超高溫滅菌乳(UHT)、調(diào)味乳、乳酸飲料、復(fù)原乳、酸奶、奶粉中蛋白成分進(jìn)行檢測(cè)。選擇聚乙烯醇涂層毛細(xì)管，采用檸檬酸緩沖體系，在紫外檢測(cè)214nm、分離電壓20kV條件下對(duì)乳及乳制品中的α一乳白蛋白(α－La)、β一乳球蛋白(β－Lg)、α－酪蛋白(α－CN)、β－酪蛋白(β－CN)和k－酪蛋白(k－CN)進(jìn)行分離測(cè)定。結(jié)果表明:五種蛋白的含量在原料乳(巴氏滅菌乳、市售鮮奶)、UHT乳、酸奶、調(diào)味乳、乳酸飲料、復(fù)原乳中依次降低，而UHT乳含量隨保質(zhì)期的增加而減少，奶粉中蛋白質(zhì)含量因其適應(yīng)人群而有差異。乳及乳制品中蛋白質(zhì)的含量與其存在形式、產(chǎn)地及加工工藝相關(guān)。

高效毛細(xì)管電泳，牛奶，乳制品，蛋白

乳及乳制品具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，是人體獲取蛋白質(zhì)的重要途徑。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)乳制品摻假現(xiàn)象嚴(yán)重，如三聚氰胺、皮革水解蛋白等物質(zhì)的非法添加，嚴(yán)重?fù)p害消費(fèi)者的利益和健康。國(guó)家制定的常規(guī)檢驗(yàn)方法，不能將乳品中摻入的非乳蛋白區(qū)別檢測(cè)。因此，從乳制品的特征性成分—乳源蛋白出發(fā)，對(duì)其進(jìn)行定性定量表征，并由此對(duì)乳及乳制品在生產(chǎn)、流通、儲(chǔ)存各個(gè)環(huán)節(jié)的質(zhì)量品質(zhì)進(jìn)行分析、評(píng)價(jià)、控制，對(duì)于乳品行業(yè)的良性發(fā)展具有重要的意義［1－2］。鮮牛乳含有3.0%～3.5%蛋白質(zhì)，其中80%為酪蛋白(CN)，15%為乳清蛋白。酪蛋白分別為: α－酪蛋白(α－CN)，β－酪蛋白(β－CN)，k－酪蛋白(k－CN)，乳清蛋白是在牛乳清液中，此類蛋白質(zhì)主要是α－乳白蛋白(α－La)和β－乳球蛋白(β－Lg)。毛細(xì)管電泳法被證明是一種非常有效地檢測(cè)乳蛋白的方法和控制乳制品質(zhì)量的技術(shù)［3－5］。本實(shí)驗(yàn)采用毛細(xì)管電泳方法對(duì)原料乳、市售鮮奶、不同廠家的巴氏滅菌乳、不同廠家和產(chǎn)地超高溫滅菌乳(UHT)、調(diào)味乳、乳酸飲料、復(fù)原乳、酸奶、奶粉中蛋白成分進(jìn)行檢測(cè)。考察乳品的存在形式、產(chǎn)地及加工工藝等對(duì)乳源蛋白含量的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

表1 方法的分析特征Table 1 Analytical characteristics of the method

原料乳 取自本地一乳品生產(chǎn)廠家;鮮奶 本地集市;其它樣品 均購(gòu)自本地超市;α－乳白蛋白(α－La)、β－乳球蛋白(β－Lg)、α－酪蛋白(α－CN)、β－酪蛋白(β－CN)、k－酪蛋白(k－CN)標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)Sigma公司;羥丙基甲基纖維素(HPMC) 進(jìn)口分裝;DL－二硫蘇糖醇(DTT，生物試劑) 德國(guó)Merk公司;三羥甲基胺基甲烷(Tris) 上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司;檸檬酸、檸檬酸鈉、尿素、磷酸和氫氧化鈉均為分析純。

P/ACE MDQ毛細(xì)管電泳儀(配有紫外檢測(cè)器)、聚乙烯醇涂層毛細(xì)管柱(65cm×50μmI.D.，有效長(zhǎng)度47cm) 美國(guó)Beckman公司;Satorius普及型 PB－10pH計(jì) 賽脫利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;MS3 basic渦旋振蕩器 德國(guó)IKA;Milli－Q Advantage A10超純水儀 美國(guó) Millipore公司;TGL－16G離心機(jī) 上海菲恰爾分析儀器有限公司;KQ－3200DV型數(shù)控超聲清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)條件

1.2.1.1 運(yùn)行緩沖液制備 準(zhǔn)確稱取0.2954g檸檬酸鈉，0.156g二硫代蘇糖醇(DTT)，2.0111g三羥甲基胺基甲烷(Tris)，置于100mL容量瓶中，加入6mol/L尿素溶液75mL，用H3PO4調(diào)節(jié)pH至8.0，置于冰箱中備用。

1.2.1.2 樣品緩沖液制備 準(zhǔn)確稱取4.2083g檸檬酸，0.5828g檸檬酸鈉，0.05%羥丙基甲基纖維素，置于100mL容量瓶中，加入6mol/L尿素溶液75mL，用1mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至3.0，備用。

1.2.1.3 操作條件 分離電壓20kV;壓力進(jìn)樣0.5psi，時(shí)間5s;柱溫:40℃;紫外檢測(cè)波長(zhǎng):214nm;毛細(xì)管兩次進(jìn)樣之間用水沖洗5min，檸檬酸緩沖液沖洗5min，在1min時(shí)自動(dòng)調(diào)零。

1.2.2 樣品處理

1.2.2.1 原料乳、液態(tài)奶樣品的配制 將樣品與樣品緩沖溶液按1∶4(V/V)的比例混合，室溫下放置1h，10000r/min離心，取清液，用0.45μm的濾膜過(guò)濾后直接進(jìn)樣。

1.2.2.2 酸奶樣品 稱取0.4g酸奶，加樣品緩沖溶液約1.6mL，于離心管2mL處，混合，室溫下放置1h，10000r/min離心，取清液，用0.45μm的濾膜過(guò)濾后直接進(jìn)樣。

1.2.2.3 奶粉樣品的準(zhǔn)備 稱取1g奶粉，溶于10mL水中，超聲振蕩使其充分溶解平衡。將樣品溶液與樣品緩沖溶液按1∶4(V/V)的比例混合，室溫下放置1h，10000r/min離心，取清液，用0.45μm的濾膜過(guò)濾后直接進(jìn)樣。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 分別配制 α－La、β－Lg、α－CN、β－CN、k－CN的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液15、20、30、40、20mg/mL，并置于冰箱中保存。上述標(biāo)準(zhǔn)溶液均同樣經(jīng)樣品緩沖液處理后進(jìn)樣。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 線性范圍 在1.2.1.3操作條件下，以五種標(biāo)準(zhǔn)蛋白的峰面積為縱坐標(biāo)，以標(biāo)樣的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并利用最小二階乘法進(jìn)行線性回歸，得到各蛋白的線性范圍、回歸方程及相關(guān)系數(shù)，結(jié)果如表1所示。

圖1 五種乳蛋白標(biāo)準(zhǔn)品圖譜Fig.1 Electropherograms of five kinds of milk protein standards

2.1.2 精密度 取同一樣品溶液，在1.2.1.3操作條件下，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜峰面積，計(jì)算進(jìn)樣峰面積，得RSD結(jié)果如表2所示。

表2 乳蛋白的RSD(n=6)Table 2 RSD of milk proteins(n=6)

2.1.3 回收率 精密量取適量液態(tài)奶樣品，平行取12份，3份空白，其余9分別加入低中高三種濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按1.2.2.1方法處理，在1.2.1.3操作條件下測(cè)定，加標(biāo)回收率測(cè)定結(jié)果如表3所示。

2.1.4 穩(wěn)定性

2.1.4.1 測(cè)試穩(wěn)定性 將樣品按1.2.2.1項(xiàng)方法處理之后，在0，12，24，36，40，48，60，64，68，72h按1.2.1.3操作條件下測(cè)定，結(jié)果如表4所示。

結(jié)果顯示，樣品處理完之后需在64h內(nèi)完成測(cè)定。

2.1.4.2 儲(chǔ)存穩(wěn)定性 將樣品置于4℃冰箱保存，分別于24，36，48，72h按1.2.2.1項(xiàng)進(jìn)行樣品處理，測(cè)定，并考察于－18℃保存24h情況，結(jié)果如表5所示。

結(jié)果顯示，樣品可在4℃冰箱中保存72h，不適合在－18℃冰箱中存儲(chǔ)。

表4 乳蛋白測(cè)試穩(wěn)定性Table 4 Stability of milk protein during testing

表5 乳蛋白儲(chǔ)存穩(wěn)定性Table 5 Storing stability of milk protein

表3 加標(biāo)回收率(n=3)Table 3 Recoveries of standard addition(n=3)

2.2 樣品測(cè)定

2.2.1 液態(tài)奶測(cè)定 選擇原料乳、市售鮮奶、不同廠家的巴氏滅菌乳、不同廠家、產(chǎn)地及保質(zhì)期的超高溫滅菌乳(UHT)、調(diào)味乳、乳酸飲料、復(fù)原乳進(jìn)行測(cè)定。將樣品按1.2.2.1項(xiàng)的方法處理之后，在1.2.1.3操作條件下測(cè)定，結(jié)果如表6所示。

圖2 液態(tài)奶樣品圖譜Fig.2 Electropherograms of liquid milk

2.2.2 酸奶測(cè)定 選擇本地產(chǎn)的不同廠家生產(chǎn)的酸奶樣品進(jìn)行測(cè)定。將樣品按1.2.2.2項(xiàng)方法處理之后，在1.2.1.3操作條件下測(cè)定，結(jié)果如表7所示。

2.2.3 奶粉測(cè)定 選擇不同適宜人群的奶粉樣品進(jìn)行測(cè)定。將樣品按 1.2.2.3項(xiàng)方法處理之后，在1.2.1.3操作條件下測(cè)定，結(jié)果如表8所示。

3 討論

3.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)于同一產(chǎn)地不同品牌不同保質(zhì)期的原料乳、巴氏滅菌乳、超高溫滅菌乳、調(diào)味乳、乳酸飲料以及同一品牌不同產(chǎn)地的液體乳品進(jìn)行測(cè)定，從表6可以看出，原料乳、市售鮮奶、巴氏滅菌乳的蛋白含量接近，在同類產(chǎn)品中最高;其次是超高溫(UHT)滅菌乳，UHT滅菌乳蛋白含量隨著保質(zhì)期增長(zhǎng)而下降;調(diào)味乳的蛋白質(zhì)含量與同保質(zhì)期的UHT滅菌乳相比要低;乳酸飲料中蛋白質(zhì)含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于鮮奶;說(shuō)明加工工藝會(huì)影響鮮奶及乳制品的蛋白質(zhì)含量。在對(duì)同一產(chǎn)地不同品牌及同一品牌不同產(chǎn)地的液態(tài)奶測(cè)定的結(jié)果顯示，產(chǎn)地及品牌(即奶源)的差異會(huì)造成蛋白質(zhì)含量的差異。在對(duì)市售標(biāo)注復(fù)原乳的樣品測(cè)定中未檢出乳蛋白成分，農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)中復(fù)原乳的檢測(cè)測(cè)定以糠氨酸和乳果糖含量作為定量檢測(cè)的依據(jù)，檢測(cè)前處理過(guò)程步驟較為繁瑣，時(shí)間長(zhǎng)，用高效毛細(xì)管電泳的方法區(qū)別鮮奶及復(fù)原乳也許是一條可行的路徑。

表6 液態(tài)奶樣品測(cè)定Table 6 Samples determination of liquid milk

表7 酸奶樣品測(cè)定結(jié)果Table 7 Samples determination of sour milk

表8 奶粉樣品測(cè)定結(jié)果Table 8 Samples determination of milk powder

圖3 酸奶樣品圖譜Fig.3 Electropherograms of sour milk

圖4 奶粉樣品圖譜Fig.4 Electropherograms of milk powder

3.2 本方法也適用于酸奶及奶粉中乳蛋白的測(cè)定，從表7、表8中看出，同產(chǎn)地不同品牌的酸奶由于奶源及加工工藝的差異，蛋白質(zhì)含量也有差異;奶粉由于適用的人群不同蛋白含量有相應(yīng)的變化，這些差異變化都可以用高效毛細(xì)管電泳方法檢測(cè)出來(lái)。本方法不僅適用于對(duì)于成品乳制品蛋白含量的檢測(cè)，也可以作為乳品企業(yè)從收購(gòu)原料品質(zhì)優(yōu)劣、中間工藝控制到產(chǎn)品儲(chǔ)存等各個(gè)環(huán)節(jié)控制乳品質(zhì)量的手段。

4 結(jié)論

乳及乳制品中蛋白質(zhì)的含量與其存在形式、產(chǎn)地及加工工藝相關(guān)。毛細(xì)管電泳方法是一種測(cè)定乳及乳制品中乳源蛋白的有效手段，乳蛋白是乳及乳制品中重要的營(yíng)養(yǎng)組成，對(duì)乳蛋白含量的測(cè)定避免了非乳蛋白的干擾，既為乳制品質(zhì)量提供了有效控制的途徑，也可以作為營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)的依據(jù)。

［1］宋宏新，柏紅梅，薛海燕，等.基于乳源蛋白質(zhì)分析的乳品質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)探討［J］.食品工業(yè)科技，2008，29(9):298－301.

［2］李春，劉麗波，劉寧.毛細(xì)管電泳技術(shù)評(píng)價(jià)乳制品質(zhì)量的研究［J］.食品工業(yè)科技，2008，29(5):288－290.

［3］Patrick C，Samson O A，Roberta B.A study of polymorphism in milk proteins from local and imported dairy sheep in Australia by capillary electrophoresis［J］.LWT，2006，39:63－69.

［4］Heck J M L，Oliemanb C，Schenninkc A，et al.Estimation of variation in concentration，hosphorylation and geneticpolymorphism of milk proteins using capillary zone electrophoresis［J］. International Dairy Journal，2008，18:548－555.

［5］劉婷，姜金斗，劉寧.3種毛細(xì)管電泳方法分析牛乳蛋白的比較［J］.食品科技，2007(8):214－218.

Study on milk proteins in milk and milk products by capillary electrophoresis

TIAN Lan，MA Xiao－li，CHEN Chun－li，MENG Lei，LI Xin－xia*
(Analysis and Test Center of Pharmacy College of Xinjiang Medical University，Urumqi 830011，China)

The contents of milk protein were determined by capillary electrophoresis in raw milk，fresh milk in market，pasteurized milk from different plants，ultra－h(huán)igh temperature(UHT)milk from different plants and fields，sterilized flavor milk，lactic acid beverage，reconstituted milk，sour milk and milk powder.The proteins of α－La，β－Lg，α－CN，β－CN and k－CN were separated and analyzed by using polyvinyl alcohol coated capillary column and citric acid buffer solution with running voltage of 20kV and UV detection at 214nm.The results showed that the contents of five proteins decreased systematically in raw milk(fresh milk，pasteurized milk)，UHT milk，sour milk，sterilized flavor milk，lactic acid beverage and reconstituted milk.And the contents of proteins in UHT milk decreased with the increase of their shelf life，the contents of proteins was changed with appropriate population. The contents of proteins in milk and milk products were related with their existing form，producing area and processing technology.

high performance capillary electrophoresis(HPCE);milk;milk products;protein

TS252.7

A

1002－0306(2012)08－0108－05

2011－05－17 *通訊聯(lián)系人

田蘭(1977－)，女，碩士，講師，研究方向:食品藥品質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)。

新疆維吾爾自治區(qū)高校科研計(jì)劃青年教師啟動(dòng)基金(XJMEDU20082008S39)。