朱砂安神丸定量指紋圖譜可靠度研究

孫國祥， 尹 霞

（沈陽藥科大學藥學院，遼寧 沈陽 110016）

朱砂安神丸(ZSASW)來源于李東垣的《內外傷辨惑論》，每丸含0.9 g朱砂，1.35 g黃連，0.9 g地黃，0.9 g當歸和0.45 g甘草，有清心養血，鎮驚安神之功效，常用于心火上炎，熱傷陰血所致的胸中煩熱，心悸不寧，失眠多夢等［1］。文獻有測定朱砂安神丸中硫化汞和小檗堿及指紋圖譜研究［2-3］。本實驗建立朱砂安神丸指紋譜并評價其可靠度，實現對化學指紋數量分布、含有量分布比例和整體含有量差異評價時具有的可靠度，成為中藥指紋圖譜鑒定中藥質量的再評價方法。

1 對照指紋圖譜可靠度評價［4-5］

由10批以上代表性樣品指紋譜按均值法計算生成對照指紋圖譜(RFP)必然產生不確定度。系統指紋定量法(SQFM)是根據宏定性相似度Sm(SF和S'F均值)和宏定量相似度Pm(P和C均值)及指紋變異系數α來整體監測樣品化學指紋總體含量。中藥對照指紋圖譜是m批樣品指紋平均模式(Sm=1，Pm=100%，α=0)，分別用 m 批樣品 SF，S'F'，C，P標準偏差除即為不確定度見(1)式。把1扣除不確定度后得對照指紋譜宏定性可靠度SR見(2)式和宏定量可靠度PR見(3)式，二者越接近1表明對照指紋圖譜越可靠。

2 單批指紋圖譜可靠度評價［6-8］

單批指紋譜不確定度決定于指紋均化性變動系數α，見(4)式，依據 f，r，C，P得定性不確定度Ufj、比率定性不確定度Urj、投影含量不確定度UCj和等權含量不確定度UPj。把1扣除單批不確定度分別得到單批宏定性可靠度SRj見(5)式和單批宏定量可靠度PRj見(6)式，二者越接近1越可靠。SQFM和可靠度R劃分標準見表1、表2。

表1 中藥質量等級劃分標準及其可靠度標準Tab.1 Division criteria for quality grade of traditional Chinese medicine

表2 中藥質量等級的不確定度和可靠度的定性劃分標準Tab.2 Qualitative division criteria of uncertaninty and reliability for quality grade of traditional Chinese medicine

3 實驗部分

3.1 儀器和試劑 Agilent 1100型液相色譜儀(美國 Agilent)；小 檗 堿 (berberine，BBR，批 號20080717)、5-羥甲基糠醛(5-hydroxymethyl furfural，5-HMF，批號111626-200503)與阿魏酸(ferulic acid，FA，批號0773-9910)對照品，由中國藥品生物制品檢定所提供；甲醇為色譜純，其他試劑為分析純；12批市售朱砂安神丸，編號S1～S12，均購自沈陽各藥店。

3.2 對照品溶液制備 精密稱取小檗堿對照品12.5 mg，置25 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。同法配制500 μg/mL阿魏酸和1 mg/mL 5-羥甲基糠醛對照品溶液。

3.3 供試品溶液制備 取朱砂安神丸1丸，剪碎，精密稱定，加甲醇50 mL，回流提取1 h，過濾，藥渣加甲醇50 mL再回流1 h，合并濾液，減壓濃縮至約16 mL，再用甲醇定容至25 mL，搖勻，作供試液。

3.4 色譜條件［3］Century SIL C18BDS柱 (200 mm ×4.6 mm，5 μm)；流動相 A 為 0.2%H3PO4溶液，B為0.1%H3PO4乙腈溶液。梯度程序:0～10 min，0% ～15%B；10～30 min，15% ～30%B；30 ～50 min，30% ～70%B；50 ～60min，70% ～85%B。體積流量1.0 mL/min，紫外檢測波長265 nm，柱溫(30 ±0.15)℃，進樣量 5 μL，洗脫時間為 66 min。

4 結果與討論

4.1 系統適用性試驗 精密吸取各對照品溶液，以及供試品溶液各5 μL，分別進樣，記錄色譜圖見圖1。比較保留時間和在線紫外光譜確定8、24和34號峰分別為5-羥甲基糠醛、阿魏酸和小檗堿。選34號峰作參照物峰，測得理論板數應不小于11600。

圖1 對照品和樣品S1的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of references and S1 sample

4.2 方法學考察 以34號峰(小檗堿)保留時間和峰面積為參照，計算各共有峰相對保留時間和相對峰面積。相對保留時間RSD均小于1.0%，精密度試驗時各共有峰相對峰面積RSD均小于4.0%；穩定性試驗時各共有峰相對峰面積RSD均小于4.0%；重復性試驗時各共有峰相對峰面積的RSD均小于4.0%。結果表明方法精密度和重現性良好，在24 h內樣品基本穩定。

4.3 指紋圖譜建立和質量評價［10-11］測定12批朱砂安神丸指紋圖譜見圖2，確定55個共有峰，以12批樣品譜按均值法生成準對照指紋譜并計算各樣品Sm和 Pm，聚類分析得 S1～S6和 S9～S12為第Ⅰ類，S7和S8為第Ⅱ類。選取第Ⅰ類按均值法生成RFP見圖2，重新評價12批樣品見表3，結果 S1、S2、S3和S4質量極好，S6、S9、S10和S12質量很好，S5和S11質量好，而S7和S8質量劣。

圖2 12批朱砂安神丸HPLC指紋譜Fig.2 HPLC fingerprints of twelve batches of Zhusha Anshen Pill

表3 12批朱砂安神丸質量評價結果Tab.3 Quality identifying results of twelve batches of Zhusha Anshen Pill

4.4 朱砂安神丸-HPLC-RFP可靠度［12-13］計算朱砂安神丸對照譜不確定度和可靠度為Uf=0.001，Ur=0.022，US=0.011，SR=0.989；UC=0.032，UP=0.026，UM=0.021，PR=0.979；其宏定性可靠度SR＞0.98表明RFP反映的化學成分數量和含有量分布比例的可靠性很高。其宏定量可靠度PR＞0.97，表明用RFP定量評價時具有很高可靠性。

4.5 12批朱砂安神丸-HPLC指紋譜可靠度［14-15］計算12批朱砂安神丸指紋譜不確定度見表4，結果S7和S8定性定量不確定度較高，其定性定量可靠度較低，說明此2個樣品代表的指紋數量分布和含有量分布及整體含有量可靠度較低。其它10批朱砂安神丸定性定量可靠度均大于0.96，表明各批指紋譜反映的化學指紋數量和含有量分布比例及整體含有量的可靠度很高。

表4 12批樣品不確定度和可靠度結果Tab.4 Results of uncertainity and reliability of twelve batches of sample

5 結論

對中藥對照指紋圖譜和單批指紋譜可靠度進行研究，對朱砂安神丸HPLC指紋譜可靠度評價，結果宏定性和宏定量可靠度均大于0.97，表明對照指紋譜具有準確可信特點。采用SQFM評價朱砂安神丸質量，對12批指紋譜所代表質量進行可靠度評價表明質量等級和可靠度無相關性。單批指紋譜可靠度僅是對鑒定結果可靠與否的評判，可靠度越大表明結果可信性越高。指紋譜定性定量不確定度是衡量指紋譜表達中藥質量時所產生的不準確性尺度，指紋譜可靠度是衡量指紋圖譜宏觀定性定量鑒定中藥質量結果可靠度的度量。本方法是中藥指紋圖譜評價中藥質量的再評價。

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