根癌農桿菌介導絲狀真菌遺傳轉化的影響因子研究進展

錢 科 胡昌華*

（西南大學藥學院 現代生物醫藥研究所，重慶 400715）

根癌農桿菌介導絲狀真菌遺傳轉化的影響因子研究進展

錢 科 胡昌華*

（西南大學藥學院 現代生物醫藥研究所，重慶 400715）

遺傳轉化體系是絲狀真菌分子生物學研究的重要工具之一。根癌農桿菌介導法因其操作簡便、轉化率高、單拷貝插入以及費用便宜等獨特的優點成為了絲狀真菌遺傳轉化的首選方法。然而，至今仍有許多種類的絲狀真菌未能實現轉化，或者轉化率太低以至于無法滿足實驗需要。本文就根癌農桿菌、受體絲狀真菌、誘導劑以及培養條件等因素對根癌農桿菌介導絲狀真菌遺傳轉化的影響進行論述，以期推動更多種類的絲狀真菌獲得高效轉化。

根癌農桿菌；絲狀真菌；遺傳轉化

根癌農桿菌是一種存在于土壤中的革蘭陰性菌，能夠感染大多數雙子葉植物的受傷部位，并將其質粒上的T-DNA插入植物基因組中。利用這一特性可以將其作為向植物基因組中導入外基因的一種有效工具。1995年Bundock等首次利用根癌農桿菌實現了釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的轉化[1]，為真菌的遺傳轉化體系的建立提供了一條新的途徑。

絲狀真菌在工業、醫藥和農業中有著重要的應用，對于絲狀真菌的分子生物學研究具有重大的科研意義和經濟價值。1998年de Groot利用根癌農桿菌成功轉化了五個絲狀真菌[2]，首次為絲狀真菌開辟了一種新的、有效且穩定的轉化途徑。相對于其他的絲狀真菌遺傳轉化方法，農桿菌介導的絲狀真菌的轉化具有轉化效率高、操作簡便、受體廣泛、單拷貝插入和遺傳穩定等優勢。

由于根癌農桿菌介導絲狀真菌的遺傳轉化方法是建立在根癌農桿菌與絲狀真菌相互協同的基礎之上的，因此整個轉化過程主要受根癌農桿菌本身的特性、受體絲狀真菌的特性、誘導劑以及共轉化條件等幾個方面的影響。本章對以上的主要的影響因素進行評述，期望能夠更好的利用根癌農桿菌對絲狀真菌進行轉化。

1 根癌農桿菌對轉化的影響

根據產生的冠癭堿種類不同，根癌農桿菌主要有章魚堿型、胭脂堿型、農桿堿型和琥珀堿型。表格1中列出了部分成功獲得轉化的絲狀真菌所使用的根癌農桿菌種類。由于各種根癌農桿菌的毒力不盡相同，且所含載體質粒不同，因此不同根癌農桿菌菌株對轉化的影響有著較大差別。Javier等人在轉化交織頂孢霉（Acremonium implicatum）的實驗中發現，AGL-1的轉化效率是EHA105的600倍[3]。2005年高興喜等人利用AGL-1成功轉化了木霉（Trichoderma harzianum），而利用LBA4404卻沒有轉化成功[4]。根據農桿菌的毒力強弱：農桿堿型菌株＞琥珀堿型＞胭脂堿型菌株＞章魚堿型菌株，研究經驗認為毒力較強的菌株具有較高的轉化效率，而有的菌株無法對特定的絲狀真菌實現轉化。

根癌農桿菌的毒力主要是由Ti（tumor-inducing）質粒上的vir（virulence genes）基因決定的，有研究顯示染色體上的vir基因也參與了轉化過程中的趨化運動和附著過程[5]。經過測序發現virA、virB、virC、virD、virE和virG這6個基因座存在于大多數的Ti質粒中，是根癌農桿菌實現高效侵染所必需的。除此之外，不同菌種之間還存在其他的vir基因座，這與其宿主的范圍有關[6]。研究顯示除virA和virG基因外的其它vir基因均需酚類化合物的誘導才能進行表達，而糖類物質、低磷酸和酸性pH環境可增強酚類化合物對vir基因的誘導[7]。

2 絲狀真菌種類對轉化的影響

研究發現，利用根癌農桿菌不僅可以介導原生質體進行轉化，還可以介導萌發的孢子、分生孢子和菌絲體進行轉化[8-10]。但由于根癌農桿菌對同種菌株的各種受體材料的侵染力不盡相同，因此轉化效率存在較大差異。有的菌株如粗球孢子菌（Coccidioides immitis）只有萌發的孢子才能實現轉化[8]；有的菌株則需要制備原生質體才能實現轉化如根霉（Rhizopus oryzae）[11]；而有的菌株目前還未能利用根癌農桿菌實現轉化如核盤菌 （Sclerotina sclerotiorum）。此外，使用新鮮的孢子比培養時間過長的孢子更易獲得轉化，報道稱這可能是與新鮮孢子的發芽率更高有關[12]。

目前，已有數十種絲狀真菌利用根癌農桿菌介導成功獲得了轉化子。表格1中列出了部分各年已經轉化成功的菌株以及其使用的標記、農桿菌種類和受體菌的形式。

3 誘導劑對轉化的影響

早在1984年，shaw等就發現酚類化合物可引起農桿菌的趨化性，而且這種趨化性依賴于virA和virG基因[13]。進一步研究發現，糖類物質可以通過ChvE這種糖周質蛋白（periplasmic sugar-binding protein，PSBP）使酚類化合物對vir基因的誘導效果成倍增加[14,15]。酚類化合物是誘導vir基因表達所必需的。雖然有研究報道多種酚類化合物具有誘導效果，如羥苯乙酮（4-hydroxyacetophenone）對香豆酸（p-coumaric acid）和苯酚（phenol），但是目前使用最廣泛的仍然是由Stachel S E等人1985年首次分離得到的乙酰丁香酮（acetosyringone，AS）[16]。乙酰丁香酮的使用濃度對于誘導的效果有著重要的影響，通常使用的濃度范圍在50-200μmol/L之間。過低濃度的乙酰丁香酮無法誘導根癌農桿菌中的vir基因表達，而過高濃度則會引起T-DNA插入拷貝數增加[17]，甚至導致受體菌株中毒[18]。研究顯示酸性pH值的環境更利于乙酰丁香酮對vir基因的誘導[19]。此外，有報道稱胭脂堿和脯氨酸等物質可與乙酰丁香酮產生協同作用[20]。

4 培養條件對轉化的影響

一般選用含有合適抗生素的 MM（minimal medium）培養液[21]對根癌農桿菌進行活化。之后將活化的菌株稀釋到OD600≈0.15，并接種到IM（induction medium）誘導培養液[21]中誘導培養至OD600≈0.6至0.8之間。雖然有報道稱誘導培養過程未加入乙酰丁香酮也能夠成功實現轉化，并且可以獲得更高單拷貝轉化子[22]，但在絕大多數絲狀真菌的轉化研究中發現，乙酰丁香酮是誘導培養所必須的。

共培養是實現根癌農桿菌介導絲狀真菌遺傳轉化的關鍵步驟。通常采用的培養基是IM固體誘導培養基[21]。在共轉化過程中，使用不同的濾膜也會使轉化效率有著較大差別。Irma Vijn等人在研究致病疫霉（ Phytophthora Infestans）的轉化時發現，使用雜交膜的轉化效率是尼龍膜的2～3倍[23]。

表1 已經轉化成功的菌株以及其使用的標記、農桿菌種類和受體菌的形式

在共培養過程中，根癌農桿菌與受體菌濃度之比對轉化效率有著明顯的影響。提高根癌農桿菌或者受體菌的濃度均可獲得相對更高的轉化效率，而當根癌農桿菌的數量和受體菌的數量達到一定比例時轉化效率最大。對于巨曲霉 （Aspergillus giganteus）的研究結果顯示，根癌農桿菌濃度與受體菌濃度的最佳比例為120:1[24]。而對于煙曲霉（Aspergillus funigatus）的研究發現其最佳比例為100:1[25]。過高濃度的根癌農桿菌會因其過度生長引起嚴重的污染，從而導致轉化率大大下降。當受體菌濃度過高時，則會導致生長過于旺盛以至于無法挑選到轉化子，并且還會導致相對轉化率降低。

根癌農桿菌將其T-DNA轉移進入受體菌株需要一定時間，而這段時間因為根癌農桿菌和受體菌的不同而存在很大差別。高興喜等人研究發現木霉（Trichoderma harzianum）的轉化在48h時的轉化率最高[4]。而Leclerque在白僵菌 （Beauveria bassiana）的轉化中則發現共培養72h時轉化率為121個轉化子/106個細胞，96h時轉化率為163個轉化子/106個細胞[26]。培養時間過短會使轉化率降低而挑選不到轉化子。培養時間過長則可能導致假陽性的產生，并且還可能因為根癌農桿菌過度生長而引起污染。

根癌農桿菌的最適生長溫度是28℃，但研究顯示，根癌農桿菌侵染的最適溫度在22℃～25℃之間[27]。過高的溫度會導致virB、virD和virE等基因座的表達受阻，因而造成根癌農桿菌的侵染力下降。此外，有研究報道T-DNA復合體的最佳組裝溫度是19℃[28]。

5 小節與展望

綜上所述，根癌農桿菌的種類與受體絲狀真菌的種類一道協同影響根癌農桿菌的轉化。這一協同效應通過影響根癌農桿菌vir基因的表達，從而影響其對宿主的選擇和侵染，最終影響到絲狀真菌轉化的效率甚至成敗。探索各vir基因如何與受體絲狀真菌協同影響根癌農桿菌對宿主選擇和侵染的研究有利于提高已成功轉化菌株的轉化效率或者實現新菌株的轉化。由于目前這方面的研究報道較少，要闡明這一機制仍需進行大量和系統的對比研究。

此外，根癌農桿菌介導的絲狀真菌轉化是一個相互協同的過程。在轉化過程中，要同時考察供體菌和受體菌的各項指標。不同供體菌株或受體菌株所要求的濃度比例、培養時間、培養溫度以及誘導等條件均需要進行探索和優化。目前，正在構建根癌農桿菌介導橘青霉（Penicillin Citrinum）的遺傳轉化體系，相關探索正在研究中。

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1671-8194（2012）09-0371-03

*通訊作者：E-mail：chhhu@swu.edu.cn