市售仔蝦中副溶血性弧菌的檢測

顧冬花

（青海大通縣樺林鄉獸醫站 810100）

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，簡稱Vp）是一種革蘭氏陰性嗜鹽菌（Halophilic bacteria），最早是由Fujino等于1953年從日本一個食物中毒患者初次分離得到。該菌為海洋性生物寄生菌，主要分布于近海岸的海水、海底沉積物及魚、貝類、海帶及蝦等海洋生物中。Vp是食用海產品引起腹瀉、嘔吐和發燒等腸胃炎的主要致病菌之一，也是近年來世界范圍內由Vp感染引發食物中毒趨于嚴重的食源性公共衛生問題之一。由Vp引起的食物中毒占日本食物中毒病例數的20%～30%[1]。在歐洲和北美地區也曾多次暴發過Vp食物中毒事件[2]。根據我國的食源性疾病監測網數據顯示，Vp中毒的發生規模及人群暴露規模呈明顯上升趨勢，均超過沙門氏菌食物中毒而躍居于微生物食源性疾病爆發的首位[3，4]，特別是在一些沿海城市，由該菌引起的食物中毒占細菌性食物中毒總數的比例高達60%以上[5-7]。由于本地銷售的仔蝦等海產品均為外省調入，在包裝或運輸過程中污染Vp的機率可能增加，為了初步摸清Vp在本地市售仔蝦中的帶菌率，提高相關檢疫機構對Vp的重視程度，降低食源性疾病的風險，2009年3～7月筆者對隨機采集于西寧市某幾個農貿市場的70份仔蝦樣品進行了常規病原分離。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 隨機采取西寧市幾個農貿市場市售仔蝦70份，（10只/份），置4℃冰箱備用。

1.1.2 氧化酶試劑 1%鹽酸二甲基對苯二胺溶液（用前配制）、1%α萘酚-乙醇溶液。

1.1.3 培養基 3%氯化鈉堿性蛋白胨水、硫代硫酸鈉、檸檬酸鈉、膽鹽、蔗糖瓊脂（TCBS）平板，嗜鹽菌選擇性平板，氯化鈉蔗糖瓊脂平板，SS平板，3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂平板，3%氯化鈉三糖鐵（TSI）瓊脂斜面，0%、3%、6%、8%、11%NaCl胰胨水及各種生化培養基均由青海大學農牧學院動物醫學系傳染病實驗室自制。

1.1.4 試驗動物 健康昆明系小白鼠5只（14～16g）均購于青海地方病研究所。

1.2 方法

1.2.1 樣品的制備 無菌剝去蝦殼后稱取25g（含內臟和肉）置于滅菌研缽中，用滅菌剪刀充分剪碎后研磨，分裝于500ml滅菌三角瓶中，再加入225ml 3%氯化鈉堿性蛋白胨水充分振蕩10min，使其成為1∶10稀釋液，再用1ml滅菌吸管吸取1∶10稀釋液1ml作10倍遞增稀釋，制成1∶100和1∶1000稀釋液。

1.2.2 增菌 分別用1ml滅菌吸管吸取上述3個稀釋液（1∶10、1∶100、1∶1000）各1ml，接種于裝有9ml 3%氯化鈉堿性蛋白胨水的滅菌試管中，每一稀釋度接種3管，37℃增菌振蕩培養8～16h。

1.2.3 分離培養 分別勾取上述變混濁的增菌液1～2環，劃線接種于氯化鈉蔗糖瓊脂平板、嗜鹽菌選擇性平板和SS平板，于37℃培養18～36h。觀察菌落形態并分別勾取1/3疑似菌落涂片進行革蘭氏染色、鏡檢。

1.2.4 細菌純化培養 分別挑取TCBS平板上的3個疑似菌落于3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂平板上進行純化培養，置4℃冰箱備用。

1.2.5 初篩試驗 （1）細胞色素氧化酶試驗。分別挑取純培養的單個菌落涂布于潔凈的濾紙條上，然后滴加1%鹽酸二甲基對苯二胺溶液一滴，陽性者再滴加1%α萘酚-乙醇溶液一滴，判定結果。（2）3%氯化鈉三糖鐵試驗。分別挑取純培養的單個菌落接種于3%氯化鈉三糖鐵瓊脂斜面并穿刺底層，37℃培養18～24h，觀察結果。（3）嗜鹽性試驗。分別挑取純培養的單個菌落依次接種于0%NaCl胰胨水、3%NaCl胰胨水、6%NaCl胰胨水、8%NaCl胰胨水和11%NaCl胰胨水中，37℃恒溫培養24～48h后，觀察結果。

1.2.6 生化試驗 分別勾取初篩試驗陽性的疑似Vp接種于葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、蕈糖、靛基質、甲基紅、硝酸鹽、乳糖、蔗糖、肌醇、水楊苷、V-P、硫化氫、尿素酶、鼠李糖和棉子糖培養基中，37℃恒溫培養24～48h，觀察結果。

1.2.7 致病性試驗 將符合Vp生化結果的菌株分別接種于3%氯化鈉三糖鐵斜面上，37℃培養18～24h后用滅菌生理鹽水無菌洗下并與麥氏比濁管進行比濁，均選取3×108濃度的菌懸液分別腹腔注射小白鼠各1只，0.5ml/只，同時用生理鹽水腹腔注射小白鼠1只作對照。

2 結果

2.1 菌落形態及培養特性

在嗜鹽菌選擇性平板上為小圓形、邊緣整齊的淺黃色菌落，經過2～3次傳代純培養后均變成均勻的小菌落，呈黃色，菌落光滑濕潤、隆起， 直徑為0.2～1mm，中心稍混濁；在氯化鈉蔗糖瓊脂平板上為圓形菌落，直徑2～3mm，半透明或不透明，沒有粘性；在SS瓊脂平板上出現了圓形、扁平、邊緣整齊、光滑濕潤、蠟滴狀的粘韌性菌落1～2mm；在TCBS平板上有4個副溶血性弧菌可疑藍綠色菌落生長，菌落形態均為圓形、邊緣整齊、濕潤、稍混濁、半透明，直徑2～4mm。

2.2 涂片、染色及鏡檢

挑取可疑菌落涂片、革蘭氏染色鏡檢可見到兩端濃染，呈棒狀、弧狀或卵圓狀多形態的革蘭氏陰性菌。

2.3 初篩試驗

2.3.1 細胞色素氧化酶 滴加1%鹽酸二甲基對苯二胺溶液變成粉紅色，再滴加1%α萘酚-乙醇溶液變成藍色，細胞色素氧化酶試驗陽性。

2.3.2 3%氯化鈉三糖鐵 底層變黃、斜面變紅、不產氣、不產硫化氫。

2.3.3 嗜鹽性 在3%、6%和8%氯化鈉胰胨水中生長良好，0%和11%氯化鈉胰胨水中不生長。

2.4 生化鑒定

結果詳見附表。

附表 副溶血性弧菌生化反應結果表

2.5 致病性試驗

4只小白鼠36～72h內死亡，對照組小白鼠飼喂1周仍健活。采取臟器進行細菌分離，獲得與原分離菌株一致的小桿菌，試驗結果表明分離菌具有較強的致病性。

3 討論

（1）在70份仔蝦中共分離出4株疑似Vp菌株，經細菌菌落形態及培養特性觀察、細胞色素氧化酶試驗、嗜鹽性試驗和生化試驗等證實分離出的4株細菌均為Vp。增菌培養陽性管數為（1，0，0），應用3管法查SN 0173-92出口食品副溶血性弧菌檢驗方法的MPN表，結果每100g仔蝦中Vp 的MPN值為360。（2）此次檢測結果顯示，西寧市市售仔蝦中存在Vp污染，致病性試驗也表明分離菌對小白鼠有致死效應，食用該產品存在安全隱患。由于本市市場銷售的海產品種類比較單一，且大多為冷凍包裝或活體長途運輸過來的海產品，新鮮度與其產區相比有所降低，而長途運輸和調運海產品的中間環節也可能增加污染Vp的風險，應該引起相關檢疫部門和廣大消費者的注意。（3）Vp是近幾年來越來越受到重視的一種海產品食物中毒菌，在很多國家都有Vp食物中毒發生，以日本及我國沿海地區發病率最高。Vp引起中毒的主要癥狀是嘔吐、水樣腹瀉或血便，甚至敗血癥、皮膚大皰性損害、反應性關節炎和類風濕性關節炎[8]；典型癥狀是腹部或臍周呈現陣發性腹絞痛，水樣腹瀉后出現膿血便，同時伴有惡心、嘔吐，體溫在38～39℃，個別患者可達40℃以上，甚至發生休克、昏迷，若搶救不及時可造成死亡[9]。因其致病性強，其發病急，傳播快，感染源多，在人群中流行的持續時間長，屬國際上檢疫傳染病之一。因此在食用各類海產品時一定要注意對該菌的衛生防范，嚴把海產品生產、加工、包裝和運輸的質量關，避免交叉污染，避免Vp引起食物中毒的發生。在食用海產品時要做到低溫貯藏，加工過程中要煮熟、煮透，切生、熟食物的廚具要分開，用完后進行嚴格的消毒處理。同時生、熟食物應分開放置，避免造成交叉污染。