奶牛三種早孕診斷方法的比較

蘇 妮 孫振師 張化恒 （山東省萊西市畜牧獸醫局 266600）

奶牛早期妊娠診斷是提高奶牛繁殖率和產奶量的重要措施，具有很高的經濟價值。最早應用的早孕診斷方法是直腸檢查法，但此法確診時間晚，勞動強度大，診斷準確率受技術水平和操作狀態的影響大，且診斷過程易對胚胎造成危害。所以自70年代開始，國內外進行了大量的實驗室早孕診斷方法的研究，如放射免疫法、酶聯免疫吸附法、免疫乳膠凝集抑制試驗等，但這些診斷早孕的方法目前仍處于進一步研究階段。為了探討適合廣大基層單位奶牛早孕診斷的方法，筆者對184頭配種后21～26d的奶牛分別用RIA.、ELISA、LAIT法進行了早孕診斷的對比試驗研究。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及采樣

1.1.1 試驗動物 選擇發情配種后21～26d的黑白花奶牛184頭。

1.1.2 奶樣采集 取每頭奶牛上午擠的混合奶為奶樣，其中一部分脫脂后作RIA法測定。

1.1.3 脫激素乳的制備 取20ml乳樣加2.0g活性炭，磁力攪拌器攪拌30min，置冰箱內過夜，2000r/min離心1h，取上清液同法每離心1次收集上清液即為去激素率98%的脫激素乳，用于ELISA法測定。

1.1.4 尿樣采集 取非晨時自然排出的尿液，用作LAIT的測定尿樣。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 RIA法的試劑與儀器 抗血清是以孕酮-11a-半琥珀酸鹽-RSA所免疫的家兔制備的，孕酮放射免疫藥盒由中國科學院動物研究所提供。

1.2.2 ELISA法試劑與儀器 抗血清同RIA法制備，辣根過氧化物酶（HRP.R2≈3.0），牛血清白蛋白，氯甲酸異丁酯，3，3′5，5′-四甲基苯胺（TMB），CP等。40孔ELISA微量測定板，S-ELISA-833型酶標測定儀。酶結合物按Dawsow（1978）和Munro（1984）的混合酸酐法合成的孕酮-辣根過氧化物酶（P-11-HRP）。工作液按石放雄的方法制備。

1.2.3 LAIT法的試劑與儀器 免疫乳膠凝集抑制妊娠診斷試劑為衛生部蘭州生物制品研究所提供。

1.3 測定方法

1.3.1 RIA法 以Heap（1976）奶中孕酮分析法和中國科學院動物研究所的血漿孕酮分析法的操作程序進行，孕酮標準曲線按Log-dose法在半對數紙上制作。測定范圍為0～800pg。

1.3.2 ELISA法 按石放雄（1987）操作程序，首先制作0～1000pg的典型孕酮濃度-光密度標準曲線和孕酮濃度-結合率標準曲線，然后同法進行乳樣測定，在酶標定量儀上讀取440um下的光密度。

1.3.3 LAIT法 在清潔的載玻片上，加1滴待測尿樣，充分拌勻3min，在顯微鏡下（100×）觀察凝集抑制反應。

1.4 判定標準及準確率的檢測

1.4.1 各測定方法的判定標準 RIA與ELISA法的判定標準為21～26d奶中孕酮含量＞4.0ng/ml為陽性（懷孕）；奶中孕酮＜2.0ng/ml為陰性（未孕）；LIAT法判定標準：若出現均勻一致的凝集顆粒為陰性（空孕）；不出現凝集顆粒為陽性（孕牛）。

1.4.2 各測定方法準確率的檢測 根據對不同妊娠的直檢診斷結果和配種、產犢記錄資料進行準確率的檢測。

2 結果與分析

2.1 不同早孕診斷方法的準確率

對配種后21～26d的184頭奶牛用RIA法診斷了51頭，用ELISA法診斷了55頭，用LAIT診斷了78頭，結果表明（表1）：RIA法與ELISA法對奶牛早孕診斷的準確率基本一致，而LAIT法早孕診斷的準確率明顯高于RIA與ELISA法。

表1 3種早孕診斷方法準確率的比較

2.2 3種早孕診斷方法應用價值分析

RIA與ELISA法其靈敏性基本一致 ，LAIT法靈敏性較高；RIA法每日可測150份奶樣，ELISA法每日可測200份奶樣，LAIT法每日可測400頭尿樣，所以LAIT法工作效率較高；RIA法與ELISA法操作復雜，所需試劑、儀器昂貴，而 LAIT法操作簡單，所用試劑、儀器簡單便宜。

3 小結與討論

（1）通過用RIA法、ELISA法和LAIT法分別對51頭、55頭、和78頭奶牛進行的早孕診斷比較，診斷準確率以LIAT法最高，達92.31%，比RIA法 與ELISA法分別提高8%和6.85%。（2）LIAT法和RIA法與ELISA法診斷的靈敏性高，操作簡單，容易掌握，工作效率高，且可現場測定，因此是基層生產單位值得大力推廣的奶牛早孕診斷方法。