紫杉醇抗喉癌細胞作用及機制的實驗研究

馬永恒，袁逸銘

（蘭州大學第二醫院，甘肅 蘭州 730030）

紫杉醇抗喉癌細胞作用及機制的實驗研究

馬永恒，袁逸銘

（蘭州大學第二醫院，甘肅 蘭州 730030）

目的 研究紫杉醇（Taxol）抗人喉鱗狀細胞癌細胞株Hep-2的作用及機制。方法 以不同濃度Taxol作用于體外培養的人喉鱗狀細胞癌細胞株Hep-2，用MTT法測定Taxol對細胞的增殖抑制率，分光光度法測定癌細胞膜唾液酸含量、膜磷脂含量及膽固醇含量變化。結果 發現紫杉醇對人喉鱗狀細胞癌細胞株Hep-2生長有明顯抑制作用，且抑制作用呈濃度依賴性。癌細胞膜分析顯示紫杉醇與細胞接觸24 h，可顯著提高膜磷脂含量，降低細胞膜唾液酸含量，但是對膽固醇含量沒有影響。結論 紫杉醇明顯抑制人喉鱗狀細胞癌細胞株Hep-2增殖，其作用機制可能與膜生化特性改變有關。

紫杉醇；人喉鱗狀細胞癌；細胞增殖

紫杉醇（Taxol）是從紅豆杉屬植物的樹皮和針葉中提取分離的生物活性成分。有臨床研究顯示，其對卵巢癌、黑色素瘤、非小細胞性肺癌和乳腺癌有明顯的抑制作用。雖然Taxol用于人喉癌臨床治療已有報道，但是其治療喉癌的具體機制不是很清楚[1～4]。本文將觀察紫杉醇對體外培養的人喉鱗狀細胞癌細胞株Hep-2增殖的影響，并從癌細胞膜唾液酸、磷脂及膽固醇含量變化方面對其作用機制進行初步探討，旨在為其在喉癌的臨床應用提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

人喉鱗狀細胞癌細胞株Hep-2（由中科院細胞所細胞庫提供），紫杉醇（由蘭州大學化工所化學教研室提供），其他試劑均為（進口或國產）分析純。

1.2 細胞培養

人喉鱗狀細胞癌細胞株Hep-2用含有1%非主要氨基酸、多種維生素、1%谷酰氨、1×10-5U·L～1青霉素、100 mg鏈霉素、20%滅活小牛血清的四季青公司RPMI1640培養液調配成一定濃度的細胞懸液，在37℃、100%相對濕度、95%空氣、5%CO2的培養箱中孵育，進行細胞傳代。

1.3 細胞增殖檢驗[5]

生長良好的細胞以1×104-6·L-1接種于96孔培養板（Falcon，USA），每孔100 μ l，再加入一定濃度的Taxol（5.1、11.1、……），對照組加入生理鹽水20 μl后，兩組都在條件為37℃、100%相對濕度、95%空氣、5%CO2培養箱中孵育24 h，每孔加入5 g·L-1的四甲基唑藍氮（MTT）10 μ l，繼續培養 4 h 進行顯色反應，以50%二甲基亞砜（DMSO）100 μl終止反應，再置培養箱中孵育16～18 h后于511型全自動酶標儀570 nm處測吸光度OD值，計算百分抑制率（計算公式：1-實驗組平均吸光度T/細胞對照組平均吸光度C）%。

1.4 藥物與細胞作用

離心收集體外培養24 h的人喉鱗狀細胞癌細胞株Hep-2，用 RPMI1650 培養液調配成 1×104-6·L-1細胞懸液，取 20 μ l接種于100 ml培養瓶，不同的培養瓶中分別加入不同劑量的Taxol，使其終濃度分別為 5.1、11.1、21.4、42.7、85.4 μg·L-1，對照組加入相應體積的生理鹽水，兩組都在條件為37℃、100%相對濕度、95%空氣、5%CO2的培養箱中孵育，每6 h更換一次含藥物的培養液，24 h后收集細胞，用Tris-HCL緩沖液（0.01 mol·L-1Tris-HCl，0.1 mmol·L-1EDTA-2Na，10 mmol·L-1蔗糖，0.8%NaCl，pH 7.4）洗滌3次并懸浮，水浴中超聲破碎細胞，30 000 g（離心力），4℃離心30 min制備細胞粗膜，用全自動生化分析儀測定蛋白含量（mg·ml-1）。

1.5 膜唾液酸含量測定

稱取細胞粗膜用0.9%生理鹽水配成10%懸浮液，按文獻法[6]在不同試管分別加入500 mg·L-1唾液酸標準溶液或10%細胞膜懸浮液20μl，再加入混合反應液20 ml，置沸水浴中加熱25min，以流水冷卻終止反應，于585 nm處測定吸收度，按下式計算膜唾液酸含量：膜唾液酸／mg·g-1prot=OD樣/OD標×500／蛋白含量。

1.6 膜磷酸含量測定

按文獻法[7]進行，選擇C1810μ m色譜柱，250mm×4.6 mm不銹鋼柱；流動相為超臨界CO2和改性劑（體積比為10∶1），其中改性劑為含0.05%（體積分數）三乙胺的乙醇溶液；流動相流速為1.1～1.3ml·min-1；柱溫為30～60℃；壓力為20～30 mPa；進樣體積為10 μl；選擇檢測波長為214 nm。按下式計算膜磷酸含量：膜磷酸含量／μmol·g-1prot=(1.187×OD-0.004)×1 000/蛋白含量。

1.7 膜膽固醇含量測定

按文獻法[8]進行，酶應用液用 0.1 mol·L-1PBS（pH7.76）配制，其中含 TritonX-1 005 ml，膽酸鈉 3 mmol·L-1，4-AAP0.5 mmol·L-1，2，4-DCP1.25 mmol·L-1，三合一酶 10 ml。所需量按上述比例增減，冰箱保存可用一周。空白管、標準管及測定管分別加入蒸餾水、2 g·L-1膽固醇的異丙醇標準液或待測樣品20 ml，再加入酶應用液3 ml后混勻，37℃保溫15 min后用空白管調零，分光光度法510 nm處測吸光度。按下式計算膜膽固醇含量：膜膽固醇/μmol·g-1prot=OD樣／OD標×2 000／蛋白含量。

2 結果

2.1 紫杉醇對人喉鱗狀細胞癌細胞株Hep-2增殖的影響

紫杉醇與細胞接觸24 h對細胞增殖的抑制率見表1。由表1可看出，紫杉醇對人喉鱗狀細胞癌細胞株Hep-2的增殖具有顯著的抑制作用，其抑制喉鱗狀細胞癌細胞株Hep-2增殖的IC50為 21.25 μg·L-1，呈明顯的濃度依賴性。

表1 紫杉醇對人喉鱗狀細胞癌細胞株Hep-2增殖的抑制率（n=4）

2.2 紫杉醇對人喉鱗狀細胞癌細胞膜唾液酸、膜磷脂及膜膽固醇含量變化的影響

21.4～85.4 μg·L-1紫杉醇與細胞接觸24 h，能使人喉鱗狀細胞癌細胞膜唾液酸含量不同程度降低，膜磷脂含量不同程度升高，但對膽固醇含量及反映膜流動性的C／P值無明顯影響（見表2）。

表2 紫杉醇對人喉鱗狀細胞癌細胞膜唾液酸、磷脂及膽固醇含量變化的影響（±s，n=4）

表2 紫杉醇對人喉鱗狀細胞癌細胞膜唾液酸、磷脂及膽固醇含量變化的影響（±s，n=4）

注：與對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

—21.4 42.7 85.4對照組紫杉醇組組別 唾液酸（μmol·g-1prot）磷脂（P）（μmol·g-1prot）膽固醇（C）（μmol·g-1prot）C/P值93.0±3.8 82.6±3.3#67.0±1.4##49.9±3.3##238.4±2.3 263.0±4.3##307.8±3.7##316.9±3.6##198.1±16.0 196.9±22.9 213.2±27.0 202.1±20.8劑量（μg·L-1）0.831 0 0.748 6 0.692 7 0.637 7

3 討論

本文將紫杉醇與人喉鱗狀細胞癌細胞接觸24 h，通過檢測細胞琥珀酸脫氫酶 (該酶將黃色的MTT還原為藍紫色物質)活性及MTT比色法敏感度反映細胞存活和增殖狀況，觀察紫杉醇對人喉鱗狀細胞癌細胞株Hep-2的抑制作用。結果表明，紫杉醇對人喉鱗狀細胞癌細胞株Hep-2有明顯的抑制作用。同時，對人喉鱗狀細胞癌細胞膜生化特性變化的分析結果表明：紫杉醇能引起人喉鱗狀細胞癌細胞膜唾液酸含量降低及膜磷脂含量升高。紫杉醇對人喉鱗狀細胞癌細胞膜唾液酸含量的影響可能與其抗癌機制有一定關系，因為唾液酸減少可影響細胞表面電荷特性、膜的物質轉運過程、抗原決定簇的暴露、免疫應答細胞活化、膜表面受體功能等與細胞增殖有關的因素[9]。膽固醇和磷脂是組成細胞膜脂質雙層的重要成分，兩者比值（C/P）是反映膜流動性大小的常用參數。已發現某些流動性腫瘤如腹水癌、白血病等的細胞膜流動性明顯增大，降低膜流動性則動物移植瘤的惡性度也隨之降低[4]。該研究表明，紫杉醇對C/P值無影響，紫杉醇在抑制人喉鱗狀細胞癌細胞增殖的同時并不涉及細胞膜流動性的變化。本實驗結果表明紫杉醇能引起人喉鱗狀細胞癌細胞膜磷脂含量升高，提示膜磷脂的變化可能與紫杉醇的抗癌機制有關。可見紫杉醇可明顯抑制人喉鱗狀細胞癌細胞株Hep-2的增殖，其作用機制可能與膜生化特性改變有關，其中對膜唾液酸含量及膜磷脂含量的影響是重要環節。

[1]Holsinger F C，Kies M S，Diaz E M Jr.Durable long-term remission with chemotherapy alone for stage II to IV laryngeal cancer[J].Clin Oncol，2009，27(12):1933～1934.

[2]Dietz A，Rudat V，Dreyhaupt J，et al.Induction chemotherapy with paclitaxel and cisplatin followed by radiotherapy forlarynx organ preservation in advanced laryngeal and hypopharyngeal cancer offers moderate late toxicity outcome （DeLOS～I～trial）[J].Eur Arch Otorhinolaryngol，2009，266（8）:1291～1300.

[3]李莉，董頻，萬夷，等.人喉癌紫杉醇耐藥細胞株的建立及其生物學特性[J].臨床耳鼻喉頭頸外科雜志，2007，21（18）:843～847.

[4]Gagnon P J，Galderisi C，Page B R，et al.Angiosarcoma developing after curative induction chemotherapy and radiotherapy for locally advanced squamous cell carcinoma of the larynx[J].Head Neck，2009，31（6）:829～832.

[5]Knab B R，Salama J K，Solanki A，et al.Functional organ preservation with definitive chemoradiotherapy for T4 laryngeal squamous cell carcinoma[J].Ann Oncol，2008，19（9）:1650～1654.

[6]徐叔云，卞如濂，陳修.藥理實驗方法學[M].3版.北京：人民衛生出版社，2002.

[7]王學軍，趙鎖奇，王仁安.超臨界流體色譜法分析大豆磷脂[J].色譜，2001，19（4）：344～346.

[8]張傳濤，史業輝，佟仲生.紫杉醇聯合腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體誘導MCF-7乳腺癌細胞系凋亡機制的研究[J].中華乳腺病雜志，2008，2（6）:661～669.

[9]Xie M，Zhou L，Hu T，et al.Intratumoral delivery of paclitaxel～loaded poly(lactic-co-glycolic acid)microspheres for Hep-2 laryngeal squamous cell carcinoma xenografts[J].Anticancer Drugs，2007，18（4）：459～466.

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1671-1246（2012）07-0112-02