胡蘿卜素柱層析分離實驗最佳材料的探究

武 洋

（平?jīng)鲠t(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，甘肅 平?jīng)?744000）

胡蘿卜素柱層析分離實驗最佳材料的探究

武 洋

（平?jīng)鲠t(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，甘肅 平?jīng)?744000）

層析法是近代生物化學(xué)中應(yīng)用較為廣泛的物理化學(xué)分析方法之一，所以許多學(xué)校在生物化學(xué)課中開設(shè)了吸附柱層析法分離胡蘿卜素實驗。該項實驗用到的實驗材料很多，如菠菜葉、胡蘿卜、紅辣椒等。研究發(fā)現(xiàn)，菠菜葉是胡蘿卜素柱層析分離實驗的最佳材料，實驗結(jié)果較穩(wěn)定，每條色帶都很清晰。

胡蘿卜素柱層析分離實驗；最佳材料；菠菜葉

1 層析法

1.1 層析法概述

層析法（Chromatography）是近代生物化學(xué)中應(yīng)用較為廣泛的物理化學(xué)分析方法之一。1906年俄國植物學(xué)家米哈伊爾·茨維特將此法用于植物色素的分離，故又稱色層分析法，最初命名采用Chromatography這一詞來描述這一技術(shù)（源于希臘文Chromatos，顏色）[1]。

該法是利用混合物中各組分分子結(jié)構(gòu)互不相同，理化性質(zhì)（溶解度、吸附力、分子大小形狀及分子極性等）各異，因而在支持物（吸附劑）上分布于不同的區(qū)帶，以達到分離的目的。層析法一般利用兩個相，一個稱固定相，一個稱流動相。目前常用的層析法根據(jù)分離原理不同而分為吸附層析、分配層析、離子交換層析、凝膠層析和親和層析法等。其中吸附層析法又可根據(jù)操作形式的不同分為柱層析法和薄板層析法等[2]。

柱層析法是用一根玻璃柱（1 cm×16 cm）內(nèi)裝吸附劑粉末（MgO、Al2O3、硅膠等），在柱頂部加入要分離的樣品溶液，再加入一定的有機溶劑（流動相）以洗脫樣品中各組分，由于吸附劑對各組分的吸附力不同及各組分在洗脫劑中的溶解度不同，因而在洗脫過程中各組分隨洗脫劑向下流動時，層析柱中連續(xù)不斷地產(chǎn)生吸附、溶解（解吸附），再吸附、再解吸附的現(xiàn)象。經(jīng)過一段時間的吸附、解吸附后，樣品中各組分即以不同的速度向下移動，逐漸分離，在柱上形成不同的區(qū)帶，先后從柱下端流出，分步收集，可供進一步鑒定[3]。

1.2 研究的目的與意義

運用層析法可分離性質(zhì)極為相似，而用一般化學(xué)方法難以分離的各種化合物[3]。為了讓學(xué)生了解柱層析分離法的基本原理及其在生物化學(xué)中的應(yīng)用，許多學(xué)校在生物化學(xué)課中開設(shè)了此項實驗。層析法的種類很多，其中利用吸附柱層析法分離胡蘿卜素的實驗以其所用儀器簡單、材料便宜受到教師的青睞。該項實驗用到的材料很多，如菠菜葉、胡蘿卜、紅辣椒等，但每種材料所呈現(xiàn)的最終結(jié)果各不相同。到底哪一種材料的實驗結(jié)果更為清晰、穩(wěn)定，能讓學(xué)生一目了然，是本次研究的目的。

2 材料與方法

2.1 實驗材料與器材

2.1.1 材料 菠菜葉、胡蘿卜、紅辣椒（濕）。

2.1.2 器材 研缽、干燥層析柱、分液漏斗、干燥試管。

2.1.3 主要試劑 95%乙醇，石油醚，2%丙酮石油醚，輕質(zhì)MgO（干燥110℃～140℃烘烤 2～4 h，粉末狀），無水Na2SO4粉末（110℃烘烤）。

2.2 實驗方法

2.2.1 實驗流程

2.2.2 實驗技術(shù)要點（1）提取。取擦干的菠菜葉、紅辣椒、胡蘿卜各10 g分別置于3個研缽中，各加95%乙醇（起破碎細胞作用）10 ml進行研磨，菠菜葉、紅辣椒和胡蘿卜研磨至糊狀，提取液顏色變深后，再各加石油醚19 ml進行萃取[4]，研磨時輕輕攪拌，以防溶液乳化，研磨好后靜置一會。取出提取液（上清液），分別置分液漏斗中，緩慢加入1/2體積的蒸餾水洗滌，至水層透明為止（一般洗滌3次），以除去提取液中的乙醇。將3種提取液醚層分別倒入3個干燥試管中，加無水Na2SO4數(shù)克去除水分，加塞備用。此時，菠菜葉提取液為深綠色，紅辣椒和胡蘿卜提取液均為橘黃色。

（2）層析柱的制備。取3根1 cm×16 cm玻璃層析管，底部分別放少量棉花，然后裝入MgO粉末，用平頂玻璃棒輕輕壓緊，至粉末達8 cm高度，裝柱要均勻、無斷層，管中MgO粉末要水平。再于柱頂蓋以無水Na2SO40.5～1 cm，將柱垂直夾在鐵架上備用。

（3）層析。取3種提取液1 ml自柱頂沿管壁加入柱頂表面，待提取液全部進入層析柱時，立即加入含2%丙酮的石油醚3 ml洗脫，使吸附在柱上的各組分逐漸展開成為數(shù)條顏色不同的色帶。丙酮可增強洗脫效果，但含量不宜過高，以免洗脫過快，使色帶分離不清晰[5]。

（4）觀察色帶。2 min后對3根玻璃層析管中條帶進行觀察。由于本實驗只需觀察色帶展開情況便可得到所要結(jié)果，是一個定性實驗，不做定量，所以不進行色素的收集工作。

3 結(jié)果與分析

3.1 理論結(jié)果

胡蘿卜素常與其他植物色素共存于綠葉蔬菜及紅辣椒、胡蘿卜中，可用乙醇、石油醚及丙酮等有機溶劑提取。當(dāng)其被MgO吸附時，由于它與其他植物色素的化學(xué)結(jié)構(gòu)不同，因此理化性質(zhì)不同，故可用層析法將其分離。最終色帶最下層為胡蘿卜素，其上依次為葉黃素、葉綠素a和葉綠素b。由于胡蘿卜素的分子量最小，在固定相中的吸附能力最弱，在洗脫劑中的溶解度最大，故在層析柱內(nèi)下移速度最快，分布在層析柱的最下端，最先被洗脫下來；葉黃素是胡蘿卜素的羥化物，分子量較胡蘿卜素大，吸附能力較強，在洗脫劑中的溶解度較小，所以條帶在胡蘿卜素的上方；再往上是葉綠素a；葉綠素b的分子量最大，吸附能力最強，在洗脫劑中的溶解度最小，所以在最上層。

3.2 實驗結(jié)果

3種材料實驗結(jié)果見圖1。

圖1 3種材料柱層析分離結(jié)果

從圖1可以看出：材料為菠菜葉時，各條色帶清晰，經(jīng)過幾次重復(fù)實驗后，結(jié)果也很穩(wěn)定，每次均能看出4條清晰色帶，尤其是胡蘿卜素遠遠地被分離開；材料為胡蘿卜和紅辣椒時，經(jīng)過重復(fù)實驗發(fā)現(xiàn)雖然胡蘿卜素含量很高，也能清晰地看到，但由于其他紅色的色素過多，與胡蘿卜素混在一起，影響了實驗結(jié)果，不能使學(xué)生一目了然，同時其他色素含量較少，也不能清晰地看到。

4 結(jié)論

由以上實驗結(jié)果可以看出，菠菜葉是胡蘿卜素柱層析分離實驗的最佳材料，實驗結(jié)果較穩(wěn)定，每條色帶都很清晰，可以清楚地看到4條色帶（見圖2），從下至上依次為：胡蘿卜素（橘黃色）、葉黃素（金黃色）、葉綠素a（藍綠色）和葉綠素b（黃綠色）。

圖2 菠菜葉柱層析分離結(jié)果

[1]謝慶娟.分析化學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2005.

[2]尹桂山.生物化學(xué)實驗指導(dǎo)[M].石家莊：河北科學(xué)技術(shù)出版社，1989.

[3]王秀奇，秦淑媛，高天慧，等.基礎(chǔ)生物化學(xué)實驗[M].2版.北京：高等教育出版社，1996.

[4]曾昭瓊.有機化學(xué)實驗[M].4版.北京：高等教育出版社，2004.

[5]耿三省，張平，王健查.胡蘿卜中胡蘿卜素含量測定方法[J].北京農(nóng)業(yè)科學(xué)，1996（2）：24～26.

G424.31

B

1671-1246（2012）07-0119-02